· Reacción en Cadena Amplificada De la Polimerasa (PCR)
· PCR y sus variantes
· Electroforesis
· Hibridación
· Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP)
· Secuenciamiento masivo paralelo (MPSS)
· Identificación de metiltransferasa de adenina del ADN (Dam-ID)
· Microensayo de unión de proteínas (PBM)
· Slot/Dot Blot
· Southern Blot
· Western Blot
· Eastern Blot
· Northern blot
· Transfección
Loci (plural) / Locus (singular)
En biología (y, por extensión, en computación evolutiva para identificar posiciones de interés sobre determinadas secuencias), un locus (del latín locus, lugar) es una posición fija sobre un cromosoma, como la posición de un gen o de un biomarcador (marcador genético). Una variante de la secuencia de ADN en un determinado locus se llama alelo. La lista ordenada de loci conocidos para un genoma particular se denomina mapa genético, mientras que se denomina cartografía genética al proceso de determinación del locus de un determinado carácter biológico.
Las células diploides y poliploides cuyos cromosomas tienen el mismo alelo en algún locus se llaman homocigotos, mientras que los que tienen diferentes alelos en un locus, heterocigotos [1].
El locus es la posición que un gen ocupa en el cromosoma o en la molécula de ácido nucleico que funciona como material hereditario. Corresponde al segmento de ADN o ARN que coincide con un gen determinado, sin tomar en consideración su secuencia de bases (es un concepto principalmente topográfico). El plural de «locus» es loci en inglés y en latín, pero en español es «locus» [2].
Fuente
http://es.wikipedia.org/wiki/Loci [1]
http://www.biorom.uma.es/contenido/Glosario/l.html [2]
Exón
Exón es una palabra formada por un apócope y una aféresis a partir de la expresión "expressed region". Corresponden a una secuencia de desoxirribonucleótidos intragénica que se transcribe y se conserva en la molécula de ARN madura (ARNm, ARNr o ARNt). Una unidad de transcripción comienza y termina en un exón; los exones inicial y final corresponden a los extremos 5’ y 3’ del ARN, respectivamente [3].
Los exones son las regiones de un gen que codifican proteínas y son las secuencias que forman la composición del ARNm maduro que dirige la síntesis de una proteína [2].
En el transcrito primario, un exón es la secuencia de ribonucleótidos que no se elimina durante el proceso de empalme/ayuste/splicing, y que, por lo tanto, forma parte del transcrito maduro (ARNm, ARNr, ARNt) [3].
Los exones son las regiones de un gen que no son separadas durante el proceso de splicing y, por tanto, se mantienen en el ARN mensajero maduro. En los genes que codifican una proteína, son los exones los que contienen la información para producir la proteína codificada en el gen. En estos casos, cada exón codifica una porción específica de la proteína completa, de manera que el conjunto de exones forma la región codificante del gen. En eucariotas los exones de un gen están separados por regiones largas de ADN (llamadas intrones) que no codifican [1].
Si bien se consideró en un primer momento que los exones (en comparación con los intrones) son los que llevan la "información" dentro de un gen, se ha demostrado que no siempre es así. Así por ejemplo existen pseudogenes que poseen la estructura de un gen activo (incluido sus exones) y sin embargo no se transcriben.
La transcripción de un gen a ADN, genera un RNA mensajero inmaduro. Este ARN mensajero lleva a cabo el proceso de splicing, en el que se escinden los intrones y las regiones no traducidas. Una vez que el ARN mensajero ha madurado, puede ser traducido a una proteína [1].
Los genes humanos están constituidos por fragmentos de dos clases: Intrones y Exones. Los exones son los fragmentos del gen que codifican aminoácidos de la proteína mientras que los intrones son fragmentos del gen que se encuentran separando los distintos exones y no codifican aminoácidos. Para realizar la síntesis de una proteína en el proceso de la transcripción primero se copia la información genética desde el ADN al ARN y se produce un ARN inmaduro que contiene una copia exacta del gen, incluyendo exones e intrones. En el proceso de maduración del ARN que ocurre en el núcleo se eliminan los intrones y se pegan los exones para formar un ARN maduro que ya puede salir del núcleo hacia el citoplasma. Es muy frecuente que los ARNm sufran lo que se denomina "splicing alternativo" o maduración alternativa por la que según el estado de la célula ésta elige la combinación de exones para componer el ARNm maduro. De esta forma una célula con un mismo gen puede fabricar diferentes proteínas adaptadas a diferentes necesidades mediante el uso alternativo de exones. Un ejemplo de este fenómeno lo encontramos en la inmunoglobulina M. En el linfocito B, la IgM es el receptor de antígeno y es una proteína de membrana que tiene un exón que codifica la porción transmembrana no soluble en agua. Tras activación, esta célula fabrica IgM soluble que carece de este exón [2].
Fuentes
http://es.wikipedia.org/wiki/Ex%C3%B3n [1]
http://www.medmol.es/glosario/16/ [2]
http://www.biorom.uma.es/contenido/Glosario/E.html [3]
VP-16
El VP-16 conocido de forma genérica como etopósido, eposin o por sus nombres comerciales Toposar®, VePesid® y Etopophos®, es una epipodofilotoxina la cual es un derivado semisintético de la podophillotoxina [1] que se extrae de la raíz de mandrágora Podophyllum peltatum [3]. Es un fármaco de quimioterapia anticanceroso ("antineoplásico" o "citotóxico"), clasificado como un "alcaloide vegetal" e "inhibidor de la topoisomerasa II" [2].
Este fármaco se utiliza en caso de cáncer testicular, de vejiga, de próstata, de pulmón, de estómago, de útero y ovario, linfomas de Hodgkin y no Hodgkin, micosis fungoide, sarcoma de Kaposi, tumor de Wilms, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing, neuroblastoma, tumores cerebrales [2], leucemias agudas, histiocitosis y tetinoblastoma [1]. También se puede administrar en un tratamiento de dosis elevadas para un trasplante de médula ósea [2]. A menudo se administra en combinación con otros fármacos. A veces también se utiliza en un régimen de acondicionamiento previo a la médula ósea o trasplante de células madre sanguíneas [4].
Se ha observado que el etopósido después de cierto período de tiempo produce leucemias secundarias al tratamiento, las cuales presentan características clínicas y citogenéticas particulares que las diferencian de la leucemia relacionada con agentes alquilantes y radioterapia [1].
Los pacientes a los que se les administra VP-16 tienen una incidencia del 30% de presentar los efectos secundarios de recuento bajo de glóbulos blancos (leucocitos) (lo cual puede hacer que corra un riesgo mayor de padecer una infección) y recuento bajo de plaquetas (puede aumentar el riesgo de padecer una hemorragia) [2].
Fuentes
http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online/?IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=p&nextAction=lnk&exprSearch=342825&indexSearch=ID [1]
http://www.chemocare.com/es/bio_es/vp_ES.asp [2]
http://nci.nih.gov/diccionario/?CdrID=44822 [3]
Fuentes
http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online/?IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=p&nextAction=lnk&exprSearch=342825&indexSearch=ID [1]
http://www.chemocare.com/es/bio_es/vp_ES.asp [2]
http://en.wikipedia.org/wiki/Etoposide [4]
RUNX1
La proteína RUNX1 (Runt-related Transcription Factor 1) es un factor de transcripción codificado en humanos por el gen runx1, y se encuentra asociado con un tipo de leucemia, M2 AML (Acute Myeloid Leukemia). Pertenece a la familia de factores de transcripción relacionados con Runt (RUNX), también llamados factores de unión al core (CBFα). Las proteínas RUNX forman un complejo heterodimérico con CBFβ (core binding factor A2), lo que confiere una mayor estabilidad y afinidad por el ADN. [1]
RUNX1 (también llamado AML1) es un gen que se altera con alta frecuencia en esta enfermedad. Se localiza en 21q22 y codifica un factor de transcripción que regula genes que participan en hematopoyesis. Esta función se lleva a cabo a través de tres isoformas de la proteína RUNX1: AML1a (250 aa.), AML1b (453 aa.) y AML1c (480 aa.). La expresión diferencial de estas isoformas se ha asociado al desarrollo de neoplasias hematológicas. [2]
Función
RUNX1 parece estar implicado en el desarrollo de la hematopoyesis. Se han asociado determinadas traslocaciones cromosómicas de este gen con varios tipos tipos de leucemia. Existen dos variantes transcripcionales que codifican diferentes isoformas de la proteína. El sitio de unión consenso para CBF ha sido identificado como una secuencia de 7 pares de bases PyGPyGGTPy (donde Py = pirimidina, G = guanina y T = timina). [1]
Fuente:
http://es.wikipedia.org/wiki/RUNX1 [1]
http://www.forosalud.uam.mx/1erforo/Foro_Salud_Memorias/Salud%20y%20procesos%20patol%C3%B3gicos/a/Leucemia-Linfoblastica-Pediatricos-Runx1_Montero%20Ruiz.pdf [2]
Función
RUNX1 parece estar implicado en el desarrollo de la hematopoyesis. Se han asociado determinadas traslocaciones cromosómicas de este gen con varios tipos tipos de leucemia. Existen dos variantes transcripcionales que codifican diferentes isoformas de la proteína. El sitio de unión consenso para CBF ha sido identificado como una secuencia de 7 pares de bases PyGPyGGTPy (donde Py = pirimidina, G = guanina y T = timina). [1]
Fuente:
http://es.wikipedia.org/wiki/RUNX1 [1]
Intrón
1. Son bloques de secuencias inactivas del ADN en los genes de eucariontes que se intercalan con los exones (secuencias que codifican la proteína) y que se transcriben, pero no se traducen.
2. Región de un gen que no codifica para una proteína.
3. Un intrón es una región del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN, a diferencia de los exones que son regiones que codifican para una determinada proteína. Los intrones son comunes en todos los tipos de ARN eucariota, especialmente en los ARN mensajeros (ARNm), además pueden encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas.
El número y longitud de los intrones varía enormemente entre especies, así como entre los genes de una misma especie. Por ejemplo, el pez globo, Takifugu rubripees, tiene pocos intrones en su genoma; mientras que los mamíferos y las angiospermas (plantas con flores) suelen presentar numerosos intrones.
4. Secuencia intragénica de desoxirribonucleótidos que se transcribe pero no se conserva en la molécula de ARN madura (ARNm, ARNr o ARNt).
5. En el transcrito primario, es la secuencia de ribonucleótidos que se elimina durante el proceso de corte y empalme (ayuste), y que, por lo tanto, no forma parte del transcrito maduro (ARNm, ARNr, ARNt). Se distinguen cuatro tipos según su forma de eliminación durante el proceso de corte y empalme (ayuste) y la clase de genes en los que se observan.
Los intrones de los grupos I, II y III se escinden mediante reacciones de transesterificación.
Los intrones del grupo I (presentes en los genes de ARNr de algunos organismos eucariotas inferiores –como, por ejemplo, Tetrahymena thermophila–, en los genes mitocondriales de hongos y en ciertos fagos) se caracterizan por carecer de secuencias consenso en los sitios de empalme, aunque pueden tenerlas en su interior, y eliminarse por un proceso autocatalítico estrechamente relacionado con la estructura secundaria y terciaria de la molécula precursora de ARN (en esta clase de intrones, una guanosina o un nucleótido de guanosina libre –guanilato, GMP, GDP o GTP– aporta el grupo OH que produce la primera transesterificación; véase la figura siguiente).
Los intrones del grupo II (presentes en genes mitocondriales de hongos) disponen de sitios de empalme con secuencias consenso (responden a la regla GT-AT) y, al igual que los del grupo I, se eliminan mediante un proceso autocatalítico dependiente de la estructura secundaria y terciaria del ARN (en este caso, una adenina cede el grupo 2’OH que produce la primera transesterificación); los intrones de los genes nucleares o del grupo III son idénticos a los del grupo II (responden a la regla GT-AT), pero, a diferencia de éstos, necesitan de la presencia del empalmosoma (o ayustosoma) para escindirse (véanse los círculos amarillos y marrones en la figura de abajo); tanto en el grupo II como en el grupo III se forma una estructura en lazo característica (lariat) cuando se empalman los exones; los intrones del grupo IV, presentes en los tRNA eucariotas, son los únicos que no se eliminan por medio de una reacción de transesterificación, sino a través de un corte endonucleásico con ligamiento ulterior. Véanse lariat, spliceosome y splicing.
Observación: intron es una voz formada por apócope y aféresis a partir de intervening sequence region. En los organismos eucariotas superiores, la mayoría de los genes se hallan interrumpidos por intrones de longitud por lo general mayor que la de los exones correspondientes. Puede haber intrones en los genes nucleares que codifican proteínas, en los genes nucleolares de ARNr o en los genes de ARNt. En los organismos procariotas, los genes suelen ser continuos, pero se han descubierto intrones en fagos y en algunos ARNt bacterianos (Véase la ilustración).
Fuente:
http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen3/ciencia3/125/htm/sec_7.htm [1 ]
http://www.policlinicagipuzkoa.com/genetica_molecular/diccionario/diccionario_h-z.php [2]
http://www.biorom.uma.es/contenido/Glosario/I.html [3,4]
http://es.wikipedia.org/wiki/Intrón [5]
2. Región de un gen que no codifica para una proteína.
3. Un intrón es una región del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN, a diferencia de los exones que son regiones que codifican para una determinada proteína. Los intrones son comunes en todos los tipos de ARN eucariota, especialmente en los ARN mensajeros (ARNm), además pueden encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas.
El número y longitud de los intrones varía enormemente entre especies, así como entre los genes de una misma especie. Por ejemplo, el pez globo, Takifugu rubripees, tiene pocos intrones en su genoma; mientras que los mamíferos y las angiospermas (plantas con flores) suelen presentar numerosos intrones.
4. Secuencia intragénica de desoxirribonucleótidos que se transcribe pero no se conserva en la molécula de ARN madura (ARNm, ARNr o ARNt).
5. En el transcrito primario, es la secuencia de ribonucleótidos que se elimina durante el proceso de corte y empalme (ayuste), y que, por lo tanto, no forma parte del transcrito maduro (ARNm, ARNr, ARNt). Se distinguen cuatro tipos según su forma de eliminación durante el proceso de corte y empalme (ayuste) y la clase de genes en los que se observan.
Los intrones de los grupos I, II y III se escinden mediante reacciones de transesterificación.
Los intrones del grupo I (presentes en los genes de ARNr de algunos organismos eucariotas inferiores –como, por ejemplo, Tetrahymena thermophila–, en los genes mitocondriales de hongos y en ciertos fagos) se caracterizan por carecer de secuencias consenso en los sitios de empalme, aunque pueden tenerlas en su interior, y eliminarse por un proceso autocatalítico estrechamente relacionado con la estructura secundaria y terciaria de la molécula precursora de ARN (en esta clase de intrones, una guanosina o un nucleótido de guanosina libre –guanilato, GMP, GDP o GTP– aporta el grupo OH que produce la primera transesterificación; véase la figura siguiente).
Los intrones del grupo II (presentes en genes mitocondriales de hongos) disponen de sitios de empalme con secuencias consenso (responden a la regla GT-AT) y, al igual que los del grupo I, se eliminan mediante un proceso autocatalítico dependiente de la estructura secundaria y terciaria del ARN (en este caso, una adenina cede el grupo 2’OH que produce la primera transesterificación); los intrones de los genes nucleares o del grupo III son idénticos a los del grupo II (responden a la regla GT-AT), pero, a diferencia de éstos, necesitan de la presencia del empalmosoma (o ayustosoma) para escindirse (véanse los círculos amarillos y marrones en la figura de abajo); tanto en el grupo II como en el grupo III se forma una estructura en lazo característica (lariat) cuando se empalman los exones; los intrones del grupo IV, presentes en los tRNA eucariotas, son los únicos que no se eliminan por medio de una reacción de transesterificación, sino a través de un corte endonucleásico con ligamiento ulterior. Véanse lariat, spliceosome y splicing.
Observación: intron es una voz formada por apócope y aféresis a partir de intervening sequence region. En los organismos eucariotas superiores, la mayoría de los genes se hallan interrumpidos por intrones de longitud por lo general mayor que la de los exones correspondientes. Puede haber intrones en los genes nucleares que codifican proteínas, en los genes nucleolares de ARNr o en los genes de ARNt. En los organismos procariotas, los genes suelen ser continuos, pero se han descubierto intrones en fagos y en algunos ARNt bacterianos (Véase la ilustración).
Fuente:
http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen3/ciencia3/125/htm/sec_7.htm [1 ]
http://www.policlinicagipuzkoa.com/genetica_molecular/diccionario/diccionario_h-z.php [2]
http://www.biorom.uma.es/contenido/Glosario/I.html [3,4]
http://es.wikipedia.org/wiki/Intrón [5]
Células HL-60
Las células HL-60 provienen de la línea célular promielítica de la leucemia humana y son utilizadas principalmente para investigación en laboratorio. Esta variedad de células fue derivada de una mujer de 36 años con leucemia promielocítica aguda en el Instituto nacional del cáncer.
HL-60 carecen de marcadores específicos para linfocitos pero expresan receptores de superficie para los fragmentos Fc de inmunoglobulinas y proteínas del sistema del complemento. También muestran actividad fagocítica, responden a estímulos quimiotácticos y su precursor predominante son los neutrófilos promielocíticos.
Proliferan continuamente en cultivos por suspensión en medios nutritivos suplidos con suero vacuno fetal, L-glutamina, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin etanesulfónico (HEPES) y antibióticos durante un tiempo cerca de 36-48 horas.
La proliferación de las células HL-60 ocurre con receptores de transferrin e insulina, que se expresan en la superficie celular. El requisito para la insulina y el transferrin es absoluto, pues la proliferación de las HL-60 cesa inmediatamente si cualquiera de estos compuestos se quita de los medios de cultivo sin suero. Con esta línea, se puede generar una inducción de la diferenciación espontánea en su maduración a granulocitos por compuestos como el dimetil sulfóxido (DMSO) o ácido retinoico. Otros compuestos como la dihidroxivitamina 1.25 D3, 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) y GM-CSF pueden inducir la diferenciación de células HL-60 a fenotipos de monocitos, macrófagos y eosinófilos.
La variedad de células cultivadas HL-60 proporciona una fuente continúa de células humanas para estudiar los acontecimientos moleculares de la diferenciación mieloide y efectos de elementos fisiológicos, farmacológicos, y virológicos en este proceso. El modelo de la célula HL-60 ha sido utilizado para estudiar el efecto de la Topoisomerasa del ADN (topo) IIα e IIβ en la diferenciación y apoptosis de células y es especialmente útil en estudios del dielectroforesis, los cuáles requieren un ambiente acuoso con células suspendidas y redondas.
Referencias
· Gallagher R, Collins S, Trujillo J, y otros (1979). "Caracterización del continuo, distinguiendo la variedad de células myeloid (HL-60) de un paciente con leucemia promyelocytic aguda". Sangre 54 (3): 713–33. PMID 288488.
· Breitman, T, S. Collins, B. Keene, el an o 80. El “reemplazo del suero por la insulina y el transferrin apoya el crecimiento y la diferenciación de la variedad de células promyelocytic humana de la leucemia, HL-60”. Exp. Célula Res. , 126, 494-498.
· Sugimoto, K, K. Yamada, M. Egashira, Y. yazaki, H. Hirai, A. Kikuchi y K. Oshimi, 1998. “La distribución temporal y espacial de la DNA Topoisomerase II se altera durante la proliferación, la diferenciación, y Apoptosis en las células HL-60”. Sangre, 91:4, 1407-1417.
· Ratanachoo, K., Gascoyne, P.r.c. y Ruchirawat, M. 2002. Detección de respuestas celulares a los toxicants por dielectrophoresis. BBA. 1564, 449-458
· Hay et al., American Type Culture Collection, 7th ed, pp127-8.
Fuente:
http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=C%C3%A9lulas+Hl-60&lang=2
http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/HL60
Células HeLa
Las células HeLa constituyen una línea de células epiteliares humanas procedentes de un carcinoma cervical (de cuello uterino), y las primeras células humanas de las cuales se estableció una línea celular permanente (inmortal). En 1951 se practicó una operación quirúrgica a la paciente Henrietta Lacks (de ahí el nombre), una mujer afroamericana de 31 años, en la cual se extrajeron células de un carcinoma en el útero con la intención de evaluar su malignidad. La paciente falleció 8 meses después a causa de su tumor.
Las células extraídas fueron invadidas por el virus del papiloma humano 18 (HPV18), transformándose en células tumorales. Hoy los investigadores sospechan que su crecimiento agresivo y su resistencia a la apoptosis se deben principalmente a una combinación con este virus, que produce una proteína que degrada p53 sin mutarla, y de alteraciones varias en los cromosomas 1, 3, 5 y 6.
Fuente:
http://es.wikipedia.org/wiki/HeLa
Vocabulario Biología Molecular
• Enzimas
• Reactivos
• Siglas
• Glosario
• Líneas celulares
· Epigenética
· Células HeLa
· Células HL-60
· Kasumi 1
· Acetilación
· Metilación
· ChIP
· Cromatina
· Histonas
· Nucleosomas
· Intrón
· Exón
· Loci
· Translocaciones
· RUNX1
· AML1
· Runt Homology Domain (RHD)
· ETO/MTG8
· VP-16
· Gen V(D)J
· Leucemia
· Lineas celulares sanguíneas
· Hematopoyesis
• Reactivos
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· Células HL-60
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· VP-16
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· Leucemia
· Lineas celulares sanguíneas
· Hematopoyesis
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Protocolo ChIP (Según Santa Cruz Biotechnology)
Lave las células dos veces con PBS en temperature ambiente, suspendiendo de nuevo a aproximadamente 5x10e5 células/ml (aproximadamente 2x10e7 células total).
Agregue el formaldehído a una concentración final de 1% e incube en la temperatura ambiente por 10 minutos.
• Termine las reacciones de cross-linking con agregando glicocola a una concentración de 0,125 M.
• Pelotilla Células (2.000 RPM, 5 minutos) y lavé una vez con PBS helado.
• Suspenda de nuevo las células en 6 ml de Lysis Buffer (sc-45000) mezclándose suavemente.
• Recoja el extracto nuclear crudo por el microcentrifugación an 2.000 RPM, 5 minutos.
• Lavé otra vez con PBS. La pelotilla puede estar congelado o el proceso se puede continuar con lo siguiente:
a) Suspenda de nuevo la pelotilla en ~1,9 ml de la lisis de alta sal (sc-45001) y transfere ha un tubo de microcentrifuga de 2 ml para el progresión de la sonicación.
b) Las condiciones de la sonicación deben de ser optimizados puesto que los resultados pueden variar usando diversos sonifiers. Las condiciones siguientes fueron establecidas usando un Sonics VC130 con una punta de prube de la extremidad de 3 milimetros.
c) Sonorice en el hielo con la configuración de salida de potencia = 5-6, modo continuo, 4 veces an 30 segundos intervalos.
d) Centrifugue el extracto por 15 minutos, 10.000 RPM en 4°: C y guarda el supernatant (chromatin).
e) Determina la concentración de la proteína de sobrenadante.
f) Para el IP paso nosotros recomedemos usando 100-500 μg proteína y 0,1-1 &mu:l TransCruz reactivo (0,2-2 μg).
NOTA: Investigadores tal vez desean considerar utilizar el conjugado anticuerpo primario para sepharose o magnetica beads como una alternativa al uso de secundaria reactivos de inmunoprecipitación. (por ejemplo, Proteína A-Agarose) como se describe aquí. Combinando anticuerpos primarios dirigidos a diferentes epitopos de la misma proteína pueden ser vantajoso en algunos casos.
• Preclear the chromatin solution by adding 50 μl Protein A/G PLUSAgarose (sc-2003) and incubate for 30 minutes at 4° C. Centrifuge at full speed for 5 minutes at 4° C.
• Productos para ayudar
• Aggegar 50 μl de Proteina A/G PLUS-Agarosa (sc-2003) e incubar por 2 hs a 4° C.
• Cosechar las particulas por centrifugado a 12000 rpm por 20 segundos y colocar el tubo en hielo
• Lavarlas particulas dos veces con 1mL de Bufer de Lisis con Alto contedido de Sales (sc-45001).
• Lavar el precipitado 4 veces con el bufer de lavado (sc-45002).
• Suspender las particulas en 400 μl de bufer de elucion (sc-45003).
• Revertir los enlaces cruzados mediante la incubacion del tubo en un bano de agua a 67 ° C, mezclando ocacionalmente a lo largo de 2 hs. Remover las particulas por centrifugado y continuar incubacion de la solucion a 67° C durante la noche
• Centrifuar por 3 minutos a 10000 para remover cualquier particula residual
• Para aislar ADN, extraer la sopa una vez con 500 μ fenol/cloroformo/alcohol isoamilico (25:24:1), batir bien y separar las fases mediante centrifugado por 3 minutos a 14000 rpm
• Guargar la fase liquida, extraer la fase organica una vez con 100 μl de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE) y combinar las fases liquidas
• Extraer la fase liquida combinada con 600 μl cloroformo/alcohol isoamilico
• La DNA puede ser concentrada usando kits disponibles en el comercio.
Agregue el formaldehído a una concentración final de 1% e incube en la temperatura ambiente por 10 minutos.
• Termine las reacciones de cross-linking con agregando glicocola a una concentración de 0,125 M.
• Pelotilla Células (2.000 RPM, 5 minutos) y lavé una vez con PBS helado.
• Suspenda de nuevo las células en 6 ml de Lysis Buffer (sc-45000) mezclándose suavemente.
• Recoja el extracto nuclear crudo por el microcentrifugación an 2.000 RPM, 5 minutos.
• Lavé otra vez con PBS. La pelotilla puede estar congelado o el proceso se puede continuar con lo siguiente:
a) Suspenda de nuevo la pelotilla en ~1,9 ml de la lisis de alta sal (sc-45001) y transfere ha un tubo de microcentrifuga de 2 ml para el progresión de la sonicación.
b) Las condiciones de la sonicación deben de ser optimizados puesto que los resultados pueden variar usando diversos sonifiers. Las condiciones siguientes fueron establecidas usando un Sonics VC130 con una punta de prube de la extremidad de 3 milimetros.
c) Sonorice en el hielo con la configuración de salida de potencia = 5-6, modo continuo, 4 veces an 30 segundos intervalos.
d) Centrifugue el extracto por 15 minutos, 10.000 RPM en 4°: C y guarda el supernatant (chromatin).
e) Determina la concentración de la proteína de sobrenadante.
f) Para el IP paso nosotros recomedemos usando 100-500 μg proteína y 0,1-1 &mu:l TransCruz reactivo (0,2-2 μg).
NOTA: Investigadores tal vez desean considerar utilizar el conjugado anticuerpo primario para sepharose o magnetica beads como una alternativa al uso de secundaria reactivos de inmunoprecipitación. (por ejemplo, Proteína A-Agarose) como se describe aquí. Combinando anticuerpos primarios dirigidos a diferentes epitopos de la misma proteína pueden ser vantajoso en algunos casos.
• Preclear the chromatin solution by adding 50 μl Protein A/G PLUSAgarose (sc-2003) and incubate for 30 minutes at 4° C. Centrifuge at full speed for 5 minutes at 4° C.
• Productos para ayudar
• Aggegar 50 μl de Proteina A/G PLUS-Agarosa (sc-2003) e incubar por 2 hs a 4° C.
• Cosechar las particulas por centrifugado a 12000 rpm por 20 segundos y colocar el tubo en hielo
• Lavarlas particulas dos veces con 1mL de Bufer de Lisis con Alto contedido de Sales (sc-45001).
• Lavar el precipitado 4 veces con el bufer de lavado (sc-45002).
• Suspender las particulas en 400 μl de bufer de elucion (sc-45003).
• Revertir los enlaces cruzados mediante la incubacion del tubo en un bano de agua a 67 ° C, mezclando ocacionalmente a lo largo de 2 hs. Remover las particulas por centrifugado y continuar incubacion de la solucion a 67° C durante la noche
• Centrifuar por 3 minutos a 10000 para remover cualquier particula residual
• Para aislar ADN, extraer la sopa una vez con 500 μ fenol/cloroformo/alcohol isoamilico (25:24:1), batir bien y separar las fases mediante centrifugado por 3 minutos a 14000 rpm
• Guargar la fase liquida, extraer la fase organica una vez con 100 μl de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE) y combinar las fases liquidas
• Extraer la fase liquida combinada con 600 μl cloroformo/alcohol isoamilico
• La DNA puede ser concentrada usando kits disponibles en el comercio.
Fuente
http://www.scbt.com/es/protocol_chromatin_immunoprecipitation_chip_assays.html
Fundamento ChIP (Según Space S.R.L.)
Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP)
Esta técnica ofrece un método simple y rápido para identificar las secuencias de ADN genómico diana unidas por factores de transcripción. Después de realizar la inmunoprecipitación de los complejos de ADN unidos por puentes cruzados a los factores de transcripción, se utilizan cebadores para genes específicos y PCR estándar para detectar sitios de unión del factor de transcripción.
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Para esto se usa un anticuerpo especifico analizado para la inmunoprecipitación y conjunto de cebadores para el control positivo de una secuencia de ADN conocida que sea reconocida por el factor de transcripción.
Fuente
http://www.spacesrl.com/sh_hp.php?act=nw&id_n=246&ln=1&tp=1
Fuente
http://www.spacesrl.com/sh_hp.php?act=nw&id_n=246&ln=1&tp=1
Fundamento ChIP (Según Invitrogen)
Inmunoprecipitación de la cromatina
La técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método poderoso para el análisis de las modificaciones epigenéticas y secuencias de ADN genómico unidas a proteínas reguladoras específicas. En pocas palabras, en la técnica de ChIP se forman puentes cruzados en los complejos proteína-ADN, luego son inmunoprecipitados, purificados y amplificados para el análisis del gen y promotor específico de los blancos conocidos por PCR en tiempo real o secuenciación o para la identificación de las secuencias de un nuevo objetivo.
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Fijación
Para la fijación se utiliza sustancia o reactivo químico capaz de unir covalentemente o mediante puentes cruzados, un factor de transcripción a una secuencia promotora. Luego, se realiza una sonicación y fragmentación del ADN.
Para obtener mejores resultados, la cromatina debe ser cortada en fragmentos uniformes de 100-250 pb para PCR convencional, 500-1000 pb para qPCR y 200-250 para secuenciación.
Immunoprecipitación
En lo posible en este paso se debe realizar una purificación simple, rápida y a pequeña escala de las inmunoglobulinas y en el posterior aislamiento de las proteínas diana. Esto se puede llevar a cabo mediante la utilización de gránulos de poliestireno superparamagnéticos debido a que ofrecen un manejo magnético suave con un mínimo de estrés físico a las proteínas diana.
Anticuerpos de calidad
Es fundamental en lo posible utilizar anticuerpos primarios dirigidos contra las proteínas de unión al ADN estudiadas que posean la mayor calidad y especificidad para obtener resultados certeros.
Purificación del ADN
En este paso mediante la experiencia en laboratorio se han obtenido mejores resultados utilizando digestión con proteinasa K.
Análisis gen específico
Después de realizar el paso de inmunoprecipitación, se pueden utilizar diferentes metodologías basadas en PCR en el análisis de genes específicos para determinar cuánto ADN de interés ha precipitado. La amplificación por PCR en tiempo real es con frecuencia la técnica preferida. Se busca obtener la mejor sensibilidad, especificidad y reproducibilidad para el análisis.
También en la actualidad existe un método relacionado con esta técnica basado en el microarreglo (ChIP-on-chip) donde el ADN inmunoprecipitado purificado se une e hibridiza a diversos tipos de microarreglos de alta resolución.
Fuente
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/RNAi-Epigenetics-and-Gene-Regulation/Chromatin-Remodeling/Chromatin-Immunoprecipitation-ChIP.html
Para la fijación se utiliza sustancia o reactivo químico capaz de unir covalentemente o mediante puentes cruzados, un factor de transcripción a una secuencia promotora. Luego, se realiza una sonicación y fragmentación del ADN.
Para obtener mejores resultados, la cromatina debe ser cortada en fragmentos uniformes de 100-250 pb para PCR convencional, 500-1000 pb para qPCR y 200-250 para secuenciación.
Immunoprecipitación
En lo posible en este paso se debe realizar una purificación simple, rápida y a pequeña escala de las inmunoglobulinas y en el posterior aislamiento de las proteínas diana. Esto se puede llevar a cabo mediante la utilización de gránulos de poliestireno superparamagnéticos debido a que ofrecen un manejo magnético suave con un mínimo de estrés físico a las proteínas diana.
Anticuerpos de calidad
Es fundamental en lo posible utilizar anticuerpos primarios dirigidos contra las proteínas de unión al ADN estudiadas que posean la mayor calidad y especificidad para obtener resultados certeros.
Purificación del ADN
En este paso mediante la experiencia en laboratorio se han obtenido mejores resultados utilizando digestión con proteinasa K.
Análisis gen específico
Después de realizar el paso de inmunoprecipitación, se pueden utilizar diferentes metodologías basadas en PCR en el análisis de genes específicos para determinar cuánto ADN de interés ha precipitado. La amplificación por PCR en tiempo real es con frecuencia la técnica preferida. Se busca obtener la mejor sensibilidad, especificidad y reproducibilidad para el análisis.
También en la actualidad existe un método relacionado con esta técnica basado en el microarreglo (ChIP-on-chip) donde el ADN inmunoprecipitado purificado se une e hibridiza a diversos tipos de microarreglos de alta resolución.
Fuente
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/RNAi-Epigenetics-and-Gene-Regulation/Chromatin-Remodeling/Chromatin-Immunoprecipitation-ChIP.html
Fundamento ChIP (Según Protocol Online)
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
Es una poderosa herramienta para la identificación de proteínas, incluyendo proteínas histonas y no histonas, asociadas con regiones específicas del genoma mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen una proteína en particular o de una modificación específica de una proteína.
El paso inicial de ChIP es el entrecruzamiento proteína-proteína y proteína-ADN en las células vivas con formaldehído. Después de la formación de puentes cruzados, las células se lisan y el material extraído se somete a una sonicación para fragmentar el ADN. Las proteínas, junto con el ADN reticulado posteriormente son inmunoprecipitadas. Luego, se invierte la unión proteína-ADN por puentes cruzados en el material inmunoprecipitado y los fragmentos de ADN se purifican y amplifican por PCR.
Hay dos tipos generales de experimentos:
· ChIP con formación de puentes cruzados (Cross-linking ChIP, X-ChIP o XChIP) que utiliza cromatina fijada con formol y una posterior fragmentación por sonicación.
· ChIP con cromatina nativa (Native chromatin immunoprecipitation, N-ChIP o NChIP) que utiliza cromatina nativa preparada por digestión de los núcleos celulares mediante una nucleasa.
Características:
· Se basa en la utilización de anticuerpos
· Tiene una duración de 4-5 días
· Posee múltiples pasos
· Utiliza una captura no covalente
http://www.promega.com/multimedia/halochip01.htm
Fundamento IP (Según Wikipedia)
• Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación (IP) es una técnica que consiste en precipitar el antígeno de la proteína en una solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína en particular de una muestra que contiene miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún momento en el procedimiento.
• Métodos
Los dos métodos generales para la inmunoprecipitación son el método de la captura directa y el método de la captura indirecta.
· Directo
Los anticuerpos que son específicos para una determinada proteína (o grupo de proteínas) son inmovilizados en un sustrato en fase sólida, como gránulos microscópicos superparamagnéticos o en granulos microscópicos de agarosa (no magnético).
Los gránulos con los anticuerpos unidos se añaden a la mezcla de proteína y las proteínas que son blanco de los anticuerpos son capturados en estos gránulos a través de los anticuerpos (es decir, son inmunoprecipitadas).
· Indirectos
Los anticuerpos que son específicos para una determinada proteína, o grupo de proteínas, se añaden directamente a la mezcla de proteínas. Los anticuerpos todavía no se hayan adheridos a un soporte en fase sólida. Los anticuerpos son libres de flotar alrededor de la mezcla de proteínas y aglutinar sus objetivos. A medida que pasa el tiempo, las bolas recubiertas de una proteína A/G se añaden a la mezcla de anticuerpos y proteínas. En este punto, los anticuerpos, que ahora están vinculados a sus objetivos, se fijaran a los gránulos.
A partir de este momento, los protocolos directos e indirectos convergen porque las muestras tienen ahora los mismos ingredientes. Ambos métodos ofrecen el mismo resultado con la proteína o los complejos de proteínas vinculados a los anticuerpos que a su vez se encuentran inmovilizados en los gránulos.
· Selección
Un enfoque indirecto es a veces preferible cuando la concentración de la proteína diana es baja o cuando la afinidad específica de los anticuerpos de la proteína es deficiente. El método indirecto se utiliza también cuando la cinética de la unión de los anticuerpos a la proteína es lenta por una variedad de razones. En la mayoría de los casos, el método directo es el predeterminado, y la opción preferida.
• Tipos
Existen varios tipos de inmunoprecipitación (IP):
· IP de proteína individual (IP)
· IP de complejos proteicos (Co-PI)
· IP de cromatina (ChIP)
· IP de ARN (RIP)
· Proteínas marcadas
• Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
La inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de unión al ADN en el genoma de una proteína particular de interés. Esta técnica da una idea de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de células vivas y tejidos. La naturaleza in vivo de este método está en contraste con otros enfoques, tradicionalmente empleados para responder a las mismas preguntas.
El principio que sustenta este ensayo es que el ADN de las proteínas de unión (incluidos los factores de transcripción y las histonas) en las células vivas pueden formar puentes cruzados con el ADN al que se están uniendo. Mediante el uso de un anticuerpo que es específico para la proteína de unión a ADN blanco, uno puede immunoprecipitar el complejo proteína-ADN de lisados celulares. La reticulación se consigue a menudo mediante la aplicación de formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces es ventajoso usar un reactivo que forme puentes cruzados más definidos y consistentes, como el peróxido di tert-butílico (DTBP). Luego de la formación de puentes cruzados (reticulación), las células se lisan y el ADN se rompe en pedazos de una longitud de 0.2-1 kb por sonicación.
En este punto la inmunoprecipitación se realiza como resultado de la depuración de los complejos proteína-ADN. Los complejos proteína-ADN purificados se calientan para revertir la formación de puentes cruzados por el formaldehído a las proteínas y complejos de ADN, permitiendo que el ADN sea separado de las proteínas. La identidad y la cantidad de los fragmentos de ADN aislado pueden ser determinados por PCR. La limitación de la realización de PCR en los fragmentos aislados es que uno debe tener una idea de qué región genómica está en la mira a fin de generar la PCR correcta.
Esta limitación es muy fácil eludir simplemente por la clonación del ADN genómico aislado en un plásmido y luego utilizando primers específicos para la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando uno quiere encontrar donde se une la proteína en el genoma a gran escala, puede ser utilizado un microarreglo de ADN (CHIP-on-chip o chip-chip) que permite la caracterización de un cistrón. Además, ha surgido recientemente la secuenciación de ChIP como una nueva tecnología que puede localizar sitios de unión a proteínas en una de alto rendimiento y de forma rentable.
Fuente
http://en.wikipedia.org/wiki/Immunoprecipitation#Chromatin_immunoprecipitation_.28ChIP.29
Fundamento ChIP (Según Lodish)
El método de inmunoprecipitación de cromatina puede revelar el estado de acetilación de las histonas en la cromatina.
En un principio las histonas son ligeramente reticuladas al ADN in vivo utilizando un agente químico que forme puentes cruzados, sea reversible y permeable a la célula. Generalmente en los laboratorios es utilizado el formaldehído para este paso debido a que posee las características necesarias.
El proceso propiamente tal, se lleva a cabo en los siguientes pasos:
Paso 1: La cromatina entrelazada es aislada y cortada a una longitud media de dos a tres nucleosomas.
Paso 2: Se añade un anticuerpo contra una determinada secuencia para una histona de cola acetilada, y (paso 3) los nucleosomas unidos son inmunoprecipitados.
Paso 4: El ADN en los fragmentos de cromatina inmunoprecipitada es liberado mediante la inversión de la formación de puentes cruzados y, a continuación se cuantifica mediante el método de PCR sensible.
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Los nucleosomas de histonas con colas acetiladas se muestran en verde.
El método puede ser utilizado para analizar la asociación in vivo de cualquier proteína con una secuencia específica de ADN mediante el uso de un anticuerpo contra la proteína de interés en el paso 2.
El método puede ser utilizado para analizar la asociación in vivo de cualquier proteína con una secuencia específica de ADN mediante el uso de un anticuerpo contra la proteína de interés en el paso 2.
Fuente
Lodish et al. Molecular Cell Biology (5ta ed). Cap 11, Pp 469.
Referencia
Rundlett SE et al., 1998, Nature 392:831
Materiales y métodos (Según Mursi)
• Reactivos
·Formaldehído (Sigma)
·Tampón de dilución de formaldehído: 0.1 M Nacl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 50 mM HEPES pH 8.0
·1.25 M glicina
·Tampón de lavado 1: 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.25% Tritón
·Tampón de lavado 2: 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.2 M NaCl
·Tampón de lisis SDS: 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.1. Se añade 1 mM PMSF e inhibidor de proteasas antes de usar.
·Tampón de dilucion ChIP: 0.01% SDS, 1.1% Tritón X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8.1. 167 mM NaCl. Se añade 1 mM PMSF e inhibidor de proteasas antes de usar.
Proteína A-Sefarosa/DNA de esperma de salmón.
Fuente
Melina Mara Mursi (2004), Universidad de Barcelona, pp 88.
http://www.tdr.cesca.es/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0521107-105308/MMM_TESIS.pdf
Fundamento ChIP (Según Mursi)
Esta técnica se basa en fijar reversiblemente con formaldehído las células o tejido de interés para provocar un entrecruzamiento proteína-proteína o proteína-DNA que están interactuando o se encuentran muy próximas (en una distancia máxima de 2 Å). Una vez fijado se generan pequeños fragmentos de DNA normalmente mediante sonicación, aunque pueden usarse también enzimas de restricción.
Luego con un anticuerpo específico se inmunoprecipita el complejo proteína-DNA, y de esta manera puede purificarse luego de revertir la unión a la proteína.
Las secuencias de interés pueden analizarse fácilmente mediante PCR usando cebadores específicos.
Fuente
Melina Mara Mursi (2004), Universidad de Barcelona, pp 88.
http://www.tdr.cesca.es/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0521107-105308/MMM_TESIS.pdf
Fundamento ChIP (Según Kuo & Allis)
La ChIP consta básicamente de dos pasos:
1) Entrecruzamiento, in vivo con formaldehído, del DNA a las proteínas unidas a éste en células para que se fijen las interacciones proteína-proteína y proteína-DNA.
2) Inmunoprecipitación de los complejos proteína-DNA con anticuerpos específicos a partir de extractos sonicados para fragmentar la cromatina.
Las secuencias específicas de DNA inmunoprecipitadas son entonces amplificadas por PCR para determinar si han sido o no enriquecidas en las muestras correspondientes para cada anticuerpo (Kuo y Allis, 1999).
Las proteínas de unión a DNA se entrecruzan con formaldehído al DNA in vivo. La cromatina se aísla y el DNA, junto a las proteínas unidas, se fragmenta por sonicación. Las proteínas unidas al DNA son inmunoprecipitadas usando anticuerpos para aislar el complejo formado con el DNA. Después se revierte el entrecruzamiento para liberar el DNA y mediante PCR se amplifican secuencias específicas.
Referencias
· Kuo MH, Allis CD. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 1999 Nov;19(3):425-33.
Fuente
http://www.cancerepigenetics.com/tecniquescas.htm
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