• Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación (IP) es una técnica que consiste en precipitar el antígeno de la proteína en una solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína en particular de una muestra que contiene miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún momento en el procedimiento.
• Métodos
Los dos métodos generales para la inmunoprecipitación son el método de la captura directa y el método de la captura indirecta.
· Directo
Los anticuerpos que son específicos para una determinada proteína (o grupo de proteínas) son inmovilizados en un sustrato en fase sólida, como gránulos microscópicos superparamagnéticos o en granulos microscópicos de agarosa (no magnético).
Los gránulos con los anticuerpos unidos se añaden a la mezcla de proteína y las proteínas que son blanco de los anticuerpos son capturados en estos gránulos a través de los anticuerpos (es decir, son inmunoprecipitadas).
· Indirectos
Los anticuerpos que son específicos para una determinada proteína, o grupo de proteínas, se añaden directamente a la mezcla de proteínas. Los anticuerpos todavía no se hayan adheridos a un soporte en fase sólida. Los anticuerpos son libres de flotar alrededor de la mezcla de proteínas y aglutinar sus objetivos. A medida que pasa el tiempo, las bolas recubiertas de una proteína A/G se añaden a la mezcla de anticuerpos y proteínas. En este punto, los anticuerpos, que ahora están vinculados a sus objetivos, se fijaran a los gránulos.
A partir de este momento, los protocolos directos e indirectos convergen porque las muestras tienen ahora los mismos ingredientes. Ambos métodos ofrecen el mismo resultado con la proteína o los complejos de proteínas vinculados a los anticuerpos que a su vez se encuentran inmovilizados en los gránulos.
· Selección
Un enfoque indirecto es a veces preferible cuando la concentración de la proteína diana es baja o cuando la afinidad específica de los anticuerpos de la proteína es deficiente. El método indirecto se utiliza también cuando la cinética de la unión de los anticuerpos a la proteína es lenta por una variedad de razones. En la mayoría de los casos, el método directo es el predeterminado, y la opción preferida.
• Tipos
Existen varios tipos de inmunoprecipitación (IP):
· IP de proteína individual (IP)
· IP de complejos proteicos (Co-PI)
· IP de cromatina (ChIP)
· IP de ARN (RIP)
· Proteínas marcadas
• Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
La inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de unión al ADN en el genoma de una proteína particular de interés. Esta técnica da una idea de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de células vivas y tejidos. La naturaleza in vivo de este método está en contraste con otros enfoques, tradicionalmente empleados para responder a las mismas preguntas.
El principio que sustenta este ensayo es que el ADN de las proteínas de unión (incluidos los factores de transcripción y las histonas) en las células vivas pueden formar puentes cruzados con el ADN al que se están uniendo. Mediante el uso de un anticuerpo que es específico para la proteína de unión a ADN blanco, uno puede immunoprecipitar el complejo proteína-ADN de lisados celulares. La reticulación se consigue a menudo mediante la aplicación de formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces es ventajoso usar un reactivo que forme puentes cruzados más definidos y consistentes, como el peróxido di tert-butílico (DTBP). Luego de la formación de puentes cruzados (reticulación), las células se lisan y el ADN se rompe en pedazos de una longitud de 0.2-1 kb por sonicación.
En este punto la inmunoprecipitación se realiza como resultado de la depuración de los complejos proteína-ADN. Los complejos proteína-ADN purificados se calientan para revertir la formación de puentes cruzados por el formaldehído a las proteínas y complejos de ADN, permitiendo que el ADN sea separado de las proteínas. La identidad y la cantidad de los fragmentos de ADN aislado pueden ser determinados por PCR. La limitación de la realización de PCR en los fragmentos aislados es que uno debe tener una idea de qué región genómica está en la mira a fin de generar la PCR correcta.
Esta limitación es muy fácil eludir simplemente por la clonación del ADN genómico aislado en un plásmido y luego utilizando primers específicos para la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando uno quiere encontrar donde se une la proteína en el genoma a gran escala, puede ser utilizado un microarreglo de ADN (CHIP-on-chip o chip-chip) que permite la caracterización de un cistrón. Además, ha surgido recientemente la secuenciación de ChIP como una nueva tecnología que puede localizar sitios de unión a proteínas en una de alto rendimiento y de forma rentable.
Fuente
http://en.wikipedia.org/wiki/Immunoprecipitation#Chromatin_immunoprecipitation_.28ChIP.29
