Lave las células dos veces con PBS en temperature ambiente, suspendiendo de nuevo a aproximadamente 5x10e5 células/ml (aproximadamente 2x10e7 células total).
Agregue el formaldehído a una concentración final de 1% e incube en la temperatura ambiente por 10 minutos.
• Termine las reacciones de cross-linking con agregando glicocola a una concentración de 0,125 M.
• Pelotilla Células (2.000 RPM, 5 minutos) y lavé una vez con PBS helado.
• Suspenda de nuevo las células en 6 ml de Lysis Buffer (sc-45000) mezclándose suavemente.
• Recoja el extracto nuclear crudo por el microcentrifugación an 2.000 RPM, 5 minutos.
• Lavé otra vez con PBS. La pelotilla puede estar congelado o el proceso se puede continuar con lo siguiente:
a) Suspenda de nuevo la pelotilla en ~1,9 ml de la lisis de alta sal (sc-45001) y transfere ha un tubo de microcentrifuga de 2 ml para el progresión de la sonicación.
b) Las condiciones de la sonicación deben de ser optimizados puesto que los resultados pueden variar usando diversos sonifiers. Las condiciones siguientes fueron establecidas usando un Sonics VC130 con una punta de prube de la extremidad de 3 milimetros.
c) Sonorice en el hielo con la configuración de salida de potencia = 5-6, modo continuo, 4 veces an 30 segundos intervalos.
d) Centrifugue el extracto por 15 minutos, 10.000 RPM en 4°: C y guarda el supernatant (chromatin).
e) Determina la concentración de la proteína de sobrenadante.
f) Para el IP paso nosotros recomedemos usando 100-500 μg proteína y 0,1-1 &mu:l TransCruz reactivo (0,2-2 μg).
NOTA: Investigadores tal vez desean considerar utilizar el conjugado anticuerpo primario para sepharose o magnetica beads como una alternativa al uso de secundaria reactivos de inmunoprecipitación. (por ejemplo, Proteína A-Agarose) como se describe aquí. Combinando anticuerpos primarios dirigidos a diferentes epitopos de la misma proteína pueden ser vantajoso en algunos casos.
• Preclear the chromatin solution by adding 50 μl Protein A/G PLUSAgarose (sc-2003) and incubate for 30 minutes at 4° C. Centrifuge at full speed for 5 minutes at 4° C.
• Productos para ayudar
• Aggegar 50 μl de Proteina A/G PLUS-Agarosa (sc-2003) e incubar por 2 hs a 4° C.
• Cosechar las particulas por centrifugado a 12000 rpm por 20 segundos y colocar el tubo en hielo
• Lavarlas particulas dos veces con 1mL de Bufer de Lisis con Alto contedido de Sales (sc-45001).
• Lavar el precipitado 4 veces con el bufer de lavado (sc-45002).
• Suspender las particulas en 400 μl de bufer de elucion (sc-45003).
• Revertir los enlaces cruzados mediante la incubacion del tubo en un bano de agua a 67 ° C, mezclando ocacionalmente a lo largo de 2 hs. Remover las particulas por centrifugado y continuar incubacion de la solucion a 67° C durante la noche
• Centrifuar por 3 minutos a 10000 para remover cualquier particula residual
• Para aislar ADN, extraer la sopa una vez con 500 μ fenol/cloroformo/alcohol isoamilico (25:24:1), batir bien y separar las fases mediante centrifugado por 3 minutos a 14000 rpm
• Guargar la fase liquida, extraer la fase organica una vez con 100 μl de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE) y combinar las fases liquidas
• Extraer la fase liquida combinada con 600 μl cloroformo/alcohol isoamilico
• La DNA puede ser concentrada usando kits disponibles en el comercio.
Agregue el formaldehído a una concentración final de 1% e incube en la temperatura ambiente por 10 minutos.
• Termine las reacciones de cross-linking con agregando glicocola a una concentración de 0,125 M.
• Pelotilla Células (2.000 RPM, 5 minutos) y lavé una vez con PBS helado.
• Suspenda de nuevo las células en 6 ml de Lysis Buffer (sc-45000) mezclándose suavemente.
• Recoja el extracto nuclear crudo por el microcentrifugación an 2.000 RPM, 5 minutos.
• Lavé otra vez con PBS. La pelotilla puede estar congelado o el proceso se puede continuar con lo siguiente:
a) Suspenda de nuevo la pelotilla en ~1,9 ml de la lisis de alta sal (sc-45001) y transfere ha un tubo de microcentrifuga de 2 ml para el progresión de la sonicación.
b) Las condiciones de la sonicación deben de ser optimizados puesto que los resultados pueden variar usando diversos sonifiers. Las condiciones siguientes fueron establecidas usando un Sonics VC130 con una punta de prube de la extremidad de 3 milimetros.
c) Sonorice en el hielo con la configuración de salida de potencia = 5-6, modo continuo, 4 veces an 30 segundos intervalos.
d) Centrifugue el extracto por 15 minutos, 10.000 RPM en 4°: C y guarda el supernatant (chromatin).
e) Determina la concentración de la proteína de sobrenadante.
f) Para el IP paso nosotros recomedemos usando 100-500 μg proteína y 0,1-1 &mu:l TransCruz reactivo (0,2-2 μg).
NOTA: Investigadores tal vez desean considerar utilizar el conjugado anticuerpo primario para sepharose o magnetica beads como una alternativa al uso de secundaria reactivos de inmunoprecipitación. (por ejemplo, Proteína A-Agarose) como se describe aquí. Combinando anticuerpos primarios dirigidos a diferentes epitopos de la misma proteína pueden ser vantajoso en algunos casos.
• Preclear the chromatin solution by adding 50 μl Protein A/G PLUSAgarose (sc-2003) and incubate for 30 minutes at 4° C. Centrifuge at full speed for 5 minutes at 4° C.
• Productos para ayudar
• Aggegar 50 μl de Proteina A/G PLUS-Agarosa (sc-2003) e incubar por 2 hs a 4° C.
• Cosechar las particulas por centrifugado a 12000 rpm por 20 segundos y colocar el tubo en hielo
• Lavarlas particulas dos veces con 1mL de Bufer de Lisis con Alto contedido de Sales (sc-45001).
• Lavar el precipitado 4 veces con el bufer de lavado (sc-45002).
• Suspender las particulas en 400 μl de bufer de elucion (sc-45003).
• Revertir los enlaces cruzados mediante la incubacion del tubo en un bano de agua a 67 ° C, mezclando ocacionalmente a lo largo de 2 hs. Remover las particulas por centrifugado y continuar incubacion de la solucion a 67° C durante la noche
• Centrifuar por 3 minutos a 10000 para remover cualquier particula residual
• Para aislar ADN, extraer la sopa una vez con 500 μ fenol/cloroformo/alcohol isoamilico (25:24:1), batir bien y separar las fases mediante centrifugado por 3 minutos a 14000 rpm
• Guargar la fase liquida, extraer la fase organica una vez con 100 μl de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE) y combinar las fases liquidas
• Extraer la fase liquida combinada con 600 μl cloroformo/alcohol isoamilico
• La DNA puede ser concentrada usando kits disponibles en el comercio.
Fuente
http://www.scbt.com/es/protocol_chromatin_immunoprecipitation_chip_assays.html
