Inmunoprecipitación de la cromatina
La técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método poderoso para el análisis de las modificaciones epigenéticas y secuencias de ADN genómico unidas a proteínas reguladoras específicas. En pocas palabras, en la técnica de ChIP se forman puentes cruzados en los complejos proteína-ADN, luego son inmunoprecipitados, purificados y amplificados para el análisis del gen y promotor específico de los blancos conocidos por PCR en tiempo real o secuenciación o para la identificación de las secuencias de un nuevo objetivo.
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Fijación
Para la fijación se utiliza sustancia o reactivo químico capaz de unir covalentemente o mediante puentes cruzados, un factor de transcripción a una secuencia promotora. Luego, se realiza una sonicación y fragmentación del ADN.
Para obtener mejores resultados, la cromatina debe ser cortada en fragmentos uniformes de 100-250 pb para PCR convencional, 500-1000 pb para qPCR y 200-250 para secuenciación.
Immunoprecipitación
En lo posible en este paso se debe realizar una purificación simple, rápida y a pequeña escala de las inmunoglobulinas y en el posterior aislamiento de las proteínas diana. Esto se puede llevar a cabo mediante la utilización de gránulos de poliestireno superparamagnéticos debido a que ofrecen un manejo magnético suave con un mínimo de estrés físico a las proteínas diana.
Anticuerpos de calidad
Es fundamental en lo posible utilizar anticuerpos primarios dirigidos contra las proteínas de unión al ADN estudiadas que posean la mayor calidad y especificidad para obtener resultados certeros.
Purificación del ADN
En este paso mediante la experiencia en laboratorio se han obtenido mejores resultados utilizando digestión con proteinasa K.
Análisis gen específico
Después de realizar el paso de inmunoprecipitación, se pueden utilizar diferentes metodologías basadas en PCR en el análisis de genes específicos para determinar cuánto ADN de interés ha precipitado. La amplificación por PCR en tiempo real es con frecuencia la técnica preferida. Se busca obtener la mejor sensibilidad, especificidad y reproducibilidad para el análisis.
También en la actualidad existe un método relacionado con esta técnica basado en el microarreglo (ChIP-on-chip) donde el ADN inmunoprecipitado purificado se une e hibridiza a diversos tipos de microarreglos de alta resolución.
Fuente
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/RNAi-Epigenetics-and-Gene-Regulation/Chromatin-Remodeling/Chromatin-Immunoprecipitation-ChIP.html
Para la fijación se utiliza sustancia o reactivo químico capaz de unir covalentemente o mediante puentes cruzados, un factor de transcripción a una secuencia promotora. Luego, se realiza una sonicación y fragmentación del ADN.
Para obtener mejores resultados, la cromatina debe ser cortada en fragmentos uniformes de 100-250 pb para PCR convencional, 500-1000 pb para qPCR y 200-250 para secuenciación.
Immunoprecipitación
En lo posible en este paso se debe realizar una purificación simple, rápida y a pequeña escala de las inmunoglobulinas y en el posterior aislamiento de las proteínas diana. Esto se puede llevar a cabo mediante la utilización de gránulos de poliestireno superparamagnéticos debido a que ofrecen un manejo magnético suave con un mínimo de estrés físico a las proteínas diana.
Anticuerpos de calidad
Es fundamental en lo posible utilizar anticuerpos primarios dirigidos contra las proteínas de unión al ADN estudiadas que posean la mayor calidad y especificidad para obtener resultados certeros.
Purificación del ADN
En este paso mediante la experiencia en laboratorio se han obtenido mejores resultados utilizando digestión con proteinasa K.
Análisis gen específico
Después de realizar el paso de inmunoprecipitación, se pueden utilizar diferentes metodologías basadas en PCR en el análisis de genes específicos para determinar cuánto ADN de interés ha precipitado. La amplificación por PCR en tiempo real es con frecuencia la técnica preferida. Se busca obtener la mejor sensibilidad, especificidad y reproducibilidad para el análisis.
También en la actualidad existe un método relacionado con esta técnica basado en el microarreglo (ChIP-on-chip) donde el ADN inmunoprecipitado purificado se une e hibridiza a diversos tipos de microarreglos de alta resolución.
Fuente
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/RNAi-Epigenetics-and-Gene-Regulation/Chromatin-Remodeling/Chromatin-Immunoprecipitation-ChIP.html
