Los plasmalógenos corresponden aprox. al 23% de los glicerofosfolípidos del sistema central humano y se encuentran en las membranas de las células de los nervios y del tejido muscular.
Son fosfoglicéridos en los que el glicerol fosfato tiene unido en el C1 mediante un enlace tipo éter, un alcohol de cadena larga. Comúnmente, la parte polar de los plasmalógenos es etanolamina, colina o serina.
Los plasmalógenos son eter fosfátidos, en estos fosfolípidos una larga cadena alquil esta sumada a uno de los oxígenos de glicerol, dando un éter.
*Método Reacción Plasmal
Haye`s (1949) crea un procedimiento específico para plasmalógenos.
Esta técnica usa cloruro de mercurio para hidrolizar la unión éter del plasmalógeno, para producir un aldehído que luego reaccionara con el reactivo de Schiff.
El cloruro de mercurio se añade al doble enlace del vinil (1,2-insaturado) éter:
El producto inicial es un hemiacetal inestable, él que inmediatamente se disocia en alcohol y aldehído:
El aldehído es posteriormente visualizado por tratamiento con el reactivo de Schiff. El átomo de mercurio permanece atacando al carbono 2 del aldehído, esta presencia también puede ser demostrada histoquímicamente.
Protocolo
-Hidrolizar la muestra en cloruro de mercurio 2% por 2 min.
-Lavar con 3 cambios de agua destilada.
-Teñir con R. de Schiff 10 min.
-Lavar en abundante agua 10 min.
-Contrastar con Hx. de Mayer 3 min.
-Lavar y Montar en glicerina.
+Resultados: Plasmalógenos (principalmente fosfatidil-etanolamina) color Magenta.
*Reacción Pseudoplasmal
La reacción “pseudoplasmal” es una reacción Schiff positiva inespecífica, para evitar errores se puede utilizar controles sin tratamiento con cloruro de mercurio o bien utilizar cortes por congelación de tejido no fijado. La fijación en formalina no solo induce reacción pseudoplasmal, sino que además provoca extracción de plasmalógenos. Afortunadamente el cloruro de mercurio actúa como fijador en los tejidos cortados por congelación.
Métodos de identificación de Glicolípidos
Los glicolípidos son macromoléculas compuestos por una ceramida (esfingosina + ácido graso) y un glúcido de cadena corta; carecen de grupo fosfato.
Los glicolípidos forman parte de la bicapa lipídica de la membrana celular; la parte glucídica de la molécula está orientada hacia el exterior de la membrana plasmática y es un componente fundamental del glicocálix, donde actúan en el reconocimiento celular y como receptores antigénicos.
Entre los principales glúcidos que forman parte de los glicolípidos encontramos: Galactosa, Manosa, Fructosa, Glucosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, Ácido siálico.
Son fuertemente hidrofílicos y son fácilmente solubles en agua. Existen 3 tipos:
- Cerebrósidos
- Sulfátidos
- Gangliósidos
Cerebrósidos
Son ceramidas de carácter neutra a las que se adiciona, por unión glicosídica al grupo hidroxilo terminal de la esfingosina, una hexosa, comúnmente β-D-galactosa.
Ceramida
Estos lípidos pueden ser demostrados por reacciones especificas de sus hexosas.
*Método de PAS modificado
- Grupos aminos convertidos a carbonilos mediante la cloramina T.
- El acido performico, oxida las uniones lípido etileno a aldehídos .
- Posterior bloqueo con dinitrofenil-hidrazina, junto con los aldehídos existentes.
*Método de Azul de toluidina/Acetona
Se utiliza principalmente en la identificación de Leucodistrófia metacromática.
Protocolo
-Con azul de toluidina 16-18 hrs. (lavar)
-Deshidratación en acetona 5 min. (montar en DPX).
+Resultados: Depósitos de sulfato café, amarillo o púrpura.
*Método de Acriflavina-DMAB
Esta técnica es una adaptación del método de tinción acriflavina para mucopolisacáridos sulfatados.
Protocolo
-Fluorescencia de complejos sulfátido-acriflavina → color naranjo en luz UV. (6 min)
-Diferenciación con Isopropanol 1 min.
-Producto de reacción pigmento estable de color rojo usando p-dimetilamino-benzaldehido por (DMAB) 30-45 seg.
+Resultados: Sulfátidos color rojo.
-Se deben usar secciones control des-lipidizadas.
Gangliósidos
Se asemejan a los cerebrósidos, pero tienen un oligosacárido en lugar de una sola hexosa.
El ácido siálico o N-acetilneuramínico está siempre presente. Ellos tienen estructuras tales como NANA (ácido neuroamínico). Presentan carácter ácido.
*Método Borohidrato - Peryodato-Schiff (BHPS)
Protocolo
- Eliminación de los grupos R-CHO existentes: reducción → Borohidrato de Na+ 0.1M (0.38%)
- Oxidación → peryodato de Na+ (0.114%). 5 min.
- Tinción con Reactivo Schiff
- Tinción de contraste: Hematoxilina de Mayer, Hematoxilina Carazzi
- Montaje.
+Resultados: Gangliósidos rojos y Núcleos azules.
*Resumen métodos de identificación de Glicolípidos
Entre los principales glúcidos que forman parte de los glicolípidos encontramos: Galactosa, Manosa, Fructosa, Glucosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, Ácido siálico.
Son fuertemente hidrofílicos y son fácilmente solubles en agua. Existen 3 tipos:
- Cerebrósidos
- Sulfátidos
- Gangliósidos
Cerebrósidos
Son ceramidas de carácter neutra a las que se adiciona, por unión glicosídica al grupo hidroxilo terminal de la esfingosina, una hexosa, comúnmente β-D-galactosa.
CeramidaEstos lípidos pueden ser demostrados por reacciones especificas de sus hexosas.
*Método de PAS modificado
- Grupos aminos convertidos a carbonilos mediante la cloramina T.
- El acido performico, oxida las uniones lípido etileno a aldehídos .
- Posterior bloqueo con dinitrofenil-hidrazina, junto con los aldehídos existentes.
- Reacción de PAS para teñir hexosas; los tejidos son incubados en ácido peryódico para oxidar las hexosas (1,2 glicol) a aldehídos, y estos son finalmente revelados por condensación con el reactivo de Schiff.
- Resultados se comparan con una sección delipidizada (glicolipidos-hexosas no lipidas).
Sulfátidos
Son cerebrósidos en los que uno de los grupos hidroxilos de la hexosa está esterificado por un ácido sulfúrico (ésteres de sulfato), presentan carácter altamente ácido.
Se utiliza principalmente en la identificación de enfermedades con depósitos de lípidos producido por un almacenamiento de sulfátido.
Este compuesto tiene la propiedad de inducir metacromasia (anilina básica) por lo que de utiliza como sustrato en esta técnica el Azul de Toluidina que es el colorante standard para exhibir metacromasia.
- Resultados se comparan con una sección delipidizada (glicolipidos-hexosas no lipidas).
Sulfátidos
Son cerebrósidos en los que uno de los grupos hidroxilos de la hexosa está esterificado por un ácido sulfúrico (ésteres de sulfato), presentan carácter altamente ácido.
Se utiliza principalmente en la identificación de enfermedades con depósitos de lípidos producido por un almacenamiento de sulfátido.
Este compuesto tiene la propiedad de inducir metacromasia (anilina básica) por lo que de utiliza como sustrato en esta técnica el Azul de Toluidina que es el colorante standard para exhibir metacromasia.
*Método de Azul de toluidina/Acetona
Se utiliza principalmente en la identificación de Leucodistrófia metacromática.
Protocolo
-Con azul de toluidina 16-18 hrs. (lavar)
-Deshidratación en acetona 5 min. (montar en DPX).
+Resultados: Depósitos de sulfato café, amarillo o púrpura.
*Método de Acriflavina-DMAB
Esta técnica es una adaptación del método de tinción acriflavina para mucopolisacáridos sulfatados.
Protocolo
-Fluorescencia de complejos sulfátido-acriflavina → color naranjo en luz UV. (6 min)
-Diferenciación con Isopropanol 1 min.
-Producto de reacción pigmento estable de color rojo usando p-dimetilamino-benzaldehido por (DMAB) 30-45 seg.
+Resultados: Sulfátidos color rojo.
-Se deben usar secciones control des-lipidizadas.
Gangliósidos
Se asemejan a los cerebrósidos, pero tienen un oligosacárido en lugar de una sola hexosa.
El ácido siálico o N-acetilneuramínico está siempre presente. Ellos tienen estructuras tales como NANA (ácido neuroamínico). Presentan carácter ácido.
*Método Borohidrato - Peryodato-Schiff (BHPS)
Protocolo
- Eliminación de los grupos R-CHO existentes: reducción → Borohidrato de Na+ 0.1M (0.38%)
- Oxidación → peryodato de Na+ (0.114%). 5 min.
- Tinción con Reactivo Schiff
- Tinción de contraste: Hematoxilina de Mayer, Hematoxilina Carazzi
- Montaje.
+Resultados: Gangliósidos rojos y Núcleos azules.
*Resumen métodos de identificación de Glicolípidos
Métodos para identificar Mielina
La mielina que rodea y aísla eléctricamente a muchos axones en las neuronas del tejido nervioso, es particularmente rica en fosfolípidos.
Esta técnica ha sido utilizada en combinación con aceite rojo O o sudan rojo, para la demostración de lípidos neutros y fosfolípidos en una misma preparación.
Protocolo
-Tratar los cortes con solucion dicromato de potasio 5% que contenga cloruro de calcio 1% por 18 hrs a RT o 2 hrs a 37º C.
-Lavar en H2Od 30 min.
-Teñir con Hemateina ácida por 2 hrs. a 37º C.
-Diferenciar en tetraborato de sodio 1 hr.
-Contrastar con verde de metilo (núcleos)
-Lavar y Montar en glicerina.
+Resultados: Lecitinas y Esfingomielinas color Azul oscuro
*Hematoxilina férrica (FeH)
Protocolo
-Fijar en formol-calcio 30 min.
-Lavar en H2Od.
-Teñir con hematoxilina férrica 7 min.
-Lavar en H2Od.
Bibliografía
-J. A. Kiernan. “Histological and Histochemical methods. Theory and Practice”. Third edition. pp 247 – 260.
-Bancroft and Gamble. “Theory and practice of Histological techniques”. Ed. 2001. pp 214 – 220.
Los Fosfoglicéridos y Fosfoesfingolípidos son los principales lípidos estructurales de las membranas del tejido nervioso, se encuentra en grandes cantidades en el encéfalo y neuronas.
Fosfatidilcolinas
Las fosfatidilcolinas son comúnmente conocidas como lecitinas, es un fosfoglicérido unido a colina y son solubles en todos los solventes lipídicos, excepto la acetona.
La fosfatidilcolina es uno de los principales constituyentes de las bicapas lipídicas de las membranas celulares.
Junto con las sales biliares, ayuda a la solubilización de los ácidos biliares en la bilis.
La fosfatidilcolina contiene mayoritariamente ácido palmítico o ácido esteárico en la posición del C1. En la posición de C2 contiene ácidos grasos insaturados de 18 carbonos como oleico, linoléico o linolénico.
Las fosfatidilcolinas son comúnmente conocidas como lecitinas, es un fosfoglicérido unido a colina y son solubles en todos los solventes lipídicos, excepto la acetona.
La fosfatidilcolina es uno de los principales constituyentes de las bicapas lipídicas de las membranas celulares.
Junto con las sales biliares, ayuda a la solubilización de los ácidos biliares en la bilis.
La fosfatidilcolina contiene mayoritariamente ácido palmítico o ácido esteárico en la posición del C1. En la posición de C2 contiene ácidos grasos insaturados de 18 carbonos como oleico, linoléico o linolénico.
*Método de Hemateína ácida-dicromato (DAH)
Es la unificación de una serie de técnicas descubiertas por diferentes autores:
-Muller: Cromación (1859)
-Weigert : Mielina posee afinidad por la hematoxilina utiizando fijadores que contienen cromato.
-Beker (1946): Métodos de cromación mas la tinción con hemateína ácida de específicos fosfolípidos que contienen colina.
Metodología Los cortes por congelación son directamente cromados, y luego los fosfoglicéridos son teñidos selectivamente con hemateína ácida (hematoxilina, peryodato de sodio y ácido acético glacial), obteniéndose un complejo metal-colorante con el cromo de color azul oscuro.
En primera instancia, los cortes son expuestos a una solución de cloruro de calcio y dicromato de calcio, este último probablemente se une covalentemente con enlaces insaturados y con la colina, además reacciona también con grupos hidroxilos adyacentes.
Es la unificación de una serie de técnicas descubiertas por diferentes autores:
-Muller: Cromación (1859)
-Weigert : Mielina posee afinidad por la hematoxilina utiizando fijadores que contienen cromato.
-Beker (1946): Métodos de cromación mas la tinción con hemateína ácida de específicos fosfolípidos que contienen colina.
Metodología Los cortes por congelación son directamente cromados, y luego los fosfoglicéridos son teñidos selectivamente con hemateína ácida (hematoxilina, peryodato de sodio y ácido acético glacial), obteniéndose un complejo metal-colorante con el cromo de color azul oscuro.
En primera instancia, los cortes son expuestos a una solución de cloruro de calcio y dicromato de calcio, este último probablemente se une covalentemente con enlaces insaturados y con la colina, además reacciona también con grupos hidroxilos adyacentes.
Esta técnica ha sido utilizada en combinación con aceite rojo O o sudan rojo, para la demostración de lípidos neutros y fosfolípidos en una misma preparación.Protocolo
-Tratar los cortes con solucion dicromato de potasio 5% que contenga cloruro de calcio 1% por 18 hrs a RT o 2 hrs a 37º C.
-Lavar en H2Od 30 min.
-Teñir con Hemateina ácida por 2 hrs. a 37º C.
-Diferenciar en tetraborato de sodio 1 hr.
-Contrastar con verde de metilo (núcleos)
-Lavar y Montar en glicerina.
+Resultados: Lecitinas y Esfingomielinas color Azul oscuro
*Hematoxilina férrica (FeH)
Una versión del principio de hematoxilina-metal fue introducido por Elleder & Lojda (1973). Rápida, simple y aparentemente más sensible que la técnica de DAH
Protocolo
-Fijar en formol-calcio 30 min.
-Lavar en H2Od.
-Teñir con hematoxilina férrica 7 min.
-Lavar en H2Od.
-Sumergir en HCl 0,2 %
-Deshidratar en acetona, aclarar en xilol y montar in DPX.
+Resultados: Fosfolípidos y Núcleos Azula
Cefalinas
La cefalina o fosfatidiletanolamina (PE) es un fosfoglicéridos presente en las membranas celulares, uno de los más abundantes en los tejidos humanos.
Está compuesta por:
- glicerol esterificado,
- hidroxilos 1 y 2 por dos ácidos grasos
- hidroxilo 3 un grupo fosfato que a su vez, se esterifica con el aminoalcohol etanolamina, un derivado del etanol.
-Deshidratar en acetona, aclarar en xilol y montar in DPX.
+Resultados: Fosfolípidos y Núcleos Azula
Cefalinas
La cefalina o fosfatidiletanolamina (PE) es un fosfoglicéridos presente en las membranas celulares, uno de los más abundantes en los tejidos humanos.
Está compuesta por:
- glicerol esterificado,
- hidroxilos 1 y 2 por dos ácidos grasos
- hidroxilo 3 un grupo fosfato que a su vez, se esterifica con el aminoalcohol etanolamina, un derivado del etanol.
*Método Ácido Hidroxamico-Oro
Demostración selectiva de fosfoglicéridos (fosfolípidos basados en glicerol).
La Hidroxilamina (NH2OH) convierte las uniones esteres de los fosfoglicéridos en ácido hidroxamico (R-CO-NH-OH), el que reduce nitrato de plata a plata metálica, finalmente estabilizada con oro, “toning” (tonificación). El ácido Hidroxamico es un agente quelante.
La hidroxilamina (destructiva) es un agente alcalino, tanto ella como sus sales son comúnmente utilizadas como agentes reductores.
Demostración selectiva de fosfoglicéridos (fosfolípidos basados en glicerol).
La Hidroxilamina (NH2OH) convierte las uniones esteres de los fosfoglicéridos en ácido hidroxamico (R-CO-NH-OH), el que reduce nitrato de plata a plata metálica, finalmente estabilizada con oro, “toning” (tonificación). El ácido Hidroxamico es un agente quelante.
La hidroxilamina (destructiva) es un agente alcalino, tanto ella como sus sales son comúnmente utilizadas como agentes reductores.
Protocolo
-Tratar los cortes con hidroxilamina. 20 min.
-Lavar con 3 cambios de agua destilada.
-Tratar con solucion de plata 2 hrs. a RT.
-Lavar con ac. acetico 1% y luego agua destilada.
-Tratar con cloridrato de oro 10 min.
-Lavar en agua destilada.
-Tratar con tiosulfato de sodio 5% por 5 min.
-Montar en glicerina.
+Resultados: Cefalinas moradas.
Esfingomielina
Las esfingomielinas son esfingolípidos que se hallan presentes en las membranas plasmáticas de las células animales, en la vaina de mielina que recubre y aísla los axones de las neuronas mielinizadas.
Deriva de la esfingosina, que es un aminoalcohol que contiene una larga cadena hidrocarbonada insaturada.
-Tratar los cortes con hidroxilamina. 20 min.
-Lavar con 3 cambios de agua destilada.
-Tratar con solucion de plata 2 hrs. a RT.
-Lavar con ac. acetico 1% y luego agua destilada.
-Tratar con cloridrato de oro 10 min.
-Lavar en agua destilada.
-Tratar con tiosulfato de sodio 5% por 5 min.
-Montar en glicerina.
+Resultados: Cefalinas moradas.
Esfingomielina
Las esfingomielinas son esfingolípidos que se hallan presentes en las membranas plasmáticas de las células animales, en la vaina de mielina que recubre y aísla los axones de las neuronas mielinizadas.
Deriva de la esfingosina, que es un aminoalcohol que contiene una larga cadena hidrocarbonada insaturada.
Los esfingolípidos están formados por tres componentes estructurales principales:
-una cadena larga, normalmente la esfingosina
-un ácido graso de longitud variable unido al carbono 2 de la cadena base
-diversas cabezas polares unidas al carbono 1
-una cadena larga, normalmente la esfingosina
-un ácido graso de longitud variable unido al carbono 2 de la cadena base
-diversas cabezas polares unidas al carbono 1
*Método de Hidróxido de sodio-FeH/DAH
El mismo método utilizado para fosfolípidos que contiene colina pueden ser empleados específicamente para identificación de esfingomielina.
Para ello se debe incubar previamente el tejido en una solución de hidróxido de sodio, para destruir los fosfoglicéridos, dejando intactos los fosfoesfingósidos (esfingomielina), resistentes a la hidrólisis alcalina.
Protocolo
-Tratar los cortes con hidróxido de sodio 2M por 1 hr.
-Lavar en abundante agua.
-Lavar con ác. acético glacial 5 s.
-Seguir con el protocolo de tinción con Hematoxilina férrica (FeH) o DAH
+Resultados: Esfingomielinas Azul.
El mismo método utilizado para fosfolípidos que contiene colina pueden ser empleados específicamente para identificación de esfingomielina.
Para ello se debe incubar previamente el tejido en una solución de hidróxido de sodio, para destruir los fosfoglicéridos, dejando intactos los fosfoesfingósidos (esfingomielina), resistentes a la hidrólisis alcalina.
Protocolo
-Tratar los cortes con hidróxido de sodio 2M por 1 hr.
-Lavar en abundante agua.
-Lavar con ác. acético glacial 5 s.
-Seguir con el protocolo de tinción con Hematoxilina férrica (FeH) o DAH
+Resultados: Esfingomielinas Azul.
Bibliografía
-J. A. Kiernan. “Histological and Histochemical methods. Theory and Practice”. Third edition. pp 247 – 260.
-Bancroft and Gamble. “Theory and practice of Histological techniques”. Ed. 2001. pp 214 – 220.
Métodos de conservación y extracción
*Conservación de Lípidos para posterior estudio
Los cortes por congelación son el mejor método para la identificación de lípidos, la exposición a alcohol, acetona, cloroformo, xilol y parafina podrían destruirlos. Algunos lípidos como los fosfolípidos, lipofucsina, y gránulos de leucocitos pueden unirse a otros elementos del tejido y resistir el procesamiento en parafina.
La fijación podría ser necesaria para la estabilización del tejido y la protección contra la putrefacción bacteriana y la autolisis. Los agentes que verdaderamente fijan lípidos son el tetróxido de osmio y el ácido crómico, pero ambos alteran la reactividad química de los lípidos. La fijación con ácido crómico vuelve completamente insoluble en solventes orgánicos a los fosfolípidos, este proceso se conoce como cremación.
El formol-calcio es el fijador de elección para histoquímica de lípidos (2% acetato de calcio + 10% formalina), los lípidos no son verdaderamente fijados por la formalina, pero los lípidos son retenidos indirectamente por estabilización de proteínas y la formación de puentes cruzados.
Algunos lípidos como las lecitinas y los plasmalógenos podrían ser degradados durante la fijación con formalina, pero estos pueden ser identificados en cortes sin fijar, porque el paso inicial de la técnica de tinción para plasmalógenos involucra una hidrólisis con cloruro de mercurio y sales mercuriales que actúan fijándolos.
De todas formas, una prolongada fijación en formalina podría provocar cristalización de lípidos neutros, perdiendo sus características físicas originales.
EL calcio actuaría tamponando la formalina, puesto que el ácido fórmico podría solubilizar lípidos. Además los iones calcio tendrían un efecto saponificador de los ácidos grasos libres, formando jabones insolubles en acetona.
Los cortes por congelación son el mejor método para la identificación de lípidos, la exposición a alcohol, acetona, cloroformo, xilol y parafina podrían destruirlos. Algunos lípidos como los fosfolípidos, lipofucsina, y gránulos de leucocitos pueden unirse a otros elementos del tejido y resistir el procesamiento en parafina.
La fijación podría ser necesaria para la estabilización del tejido y la protección contra la putrefacción bacteriana y la autolisis. Los agentes que verdaderamente fijan lípidos son el tetróxido de osmio y el ácido crómico, pero ambos alteran la reactividad química de los lípidos. La fijación con ácido crómico vuelve completamente insoluble en solventes orgánicos a los fosfolípidos, este proceso se conoce como cremación.
El formol-calcio es el fijador de elección para histoquímica de lípidos (2% acetato de calcio + 10% formalina), los lípidos no son verdaderamente fijados por la formalina, pero los lípidos son retenidos indirectamente por estabilización de proteínas y la formación de puentes cruzados.
Algunos lípidos como las lecitinas y los plasmalógenos podrían ser degradados durante la fijación con formalina, pero estos pueden ser identificados en cortes sin fijar, porque el paso inicial de la técnica de tinción para plasmalógenos involucra una hidrólisis con cloruro de mercurio y sales mercuriales que actúan fijándolos.
De todas formas, una prolongada fijación en formalina podría provocar cristalización de lípidos neutros, perdiendo sus características físicas originales.
EL calcio actuaría tamponando la formalina, puesto que el ácido fórmico podría solubilizar lípidos. Además los iones calcio tendrían un efecto saponificador de los ácidos grasos libres, formando jabones insolubles en acetona.
Método de Sulfato Azul De Nilo
Este fue el 1º método utilizado para diferenciar dos tipos de lípidos simultáneamente: neutros v/s ácidos. Este colorante comprende dos compuestos: una oxazona roja que es soluble en lípidos neutros (insoluble en agua); y una oxazina azul, que es básica y reacciona con fosfolípidos y ácidos grasos libres.
El Azul Nilo es soluble en agua y puede ser usado como colorante básico, dando tonos del azul al verde en cortes de tejido fijados en formalina e incluidos en parafina. Para su uso en histoquímica esta oxazina es oxidada, por calentado en una solución de ácido sulfúrico diluido, generando una oxazona conocida como Rojo Nilo.
El Rojo Nilo es insoluble en agua, pero se disuelve en solución de Sulfato Azul de Nilo. Además es fluorescente, por lo que se utiliza para estudios de hidrofobisidad, propiedad que pierde en presencia de agua.
Sulfatos carbohidratados a pH 1 son capaces de unir moléculas del Azul de Nilo (catiónico), resultando en un color metacromático que no debe confundirse con la tinción por Rojo Nilo. Cuando se utiliza el método de Sulfato Azul de Nilo es importante utilizar controles negativos (extracción de lípidos con acetona).
El Azul Nilo es soluble en agua y puede ser usado como colorante básico, dando tonos del azul al verde en cortes de tejido fijados en formalina e incluidos en parafina. Para su uso en histoquímica esta oxazina es oxidada, por calentado en una solución de ácido sulfúrico diluido, generando una oxazona conocida como Rojo Nilo.
El Rojo Nilo es insoluble en agua, pero se disuelve en solución de Sulfato Azul de Nilo. Además es fluorescente, por lo que se utiliza para estudios de hidrofobisidad, propiedad que pierde en presencia de agua.
Sulfatos carbohidratados a pH 1 son capaces de unir moléculas del Azul de Nilo (catiónico), resultando en un color metacromático que no debe confundirse con la tinción por Rojo Nilo. Cuando se utiliza el método de Sulfato Azul de Nilo es importante utilizar controles negativos (extracción de lípidos con acetona).
Composición y estructura de lípidos
Composición y propiedades
1) NO esterificados NI amidados
*Ácidos grasos libres:
- Biomolécula orgánica de naturaleza lipídica formada por una larga cadena hidrocarbonada lineal, de número par de átomos de carbono, en cuyo extremo hay un grupo carboxilo.
- Forman parte de los fosfolípidos y glucolípidos que constituyen la bicapa lipídica de la membrana.
*Terpenos:
- Grupo importante de componentes vegetales que tienen un origen biosintético común.
- Estructuras químicas distintas, proceden de la condensación, en N° variable, de unidades isoprénicas.
- El verdadero precursor es el ácido mevalónico, proviene del acetil coenzima A.
*Esteroides (isoprenoides):
- Derivados del núcleo del ciclo pentano perhidrofenantreno que se componen de C, H, O, N y de 4 anillos fusionados de carbono que poseen diversos grupos funcionales y tienen partes hidrofílicas e hidrofóbicas.
- Función reguladora, estructural y hormonal.
- Se sintetizan a partir de colesterol y son lipófilas que atraviesan mb.
2) ESTERIFICADOS
*Grasas neutras (TAG):
- 1 Glicerol (hidroxilos polares) + 3 Ácidos grasos repetidos (carboxilos polares) unidos por enlace ester.
- Son moléculas apolares, hidrofóbicas e insolubles en agua.
- Los triacilglicéridos son el tipo de grasas más abundantes.
*Ceras naturales:
- Ácidos grasos de cadena larga saturados e insaturados (14-36 C) + Alcoholes de cadena larga (16-30 C)
- Son ésteres de los ácidos grasos con alcoholes primarios.
- Punto de fusión alto(60-100°C), repelen el agua y proveen consistencia firme.
*Esteres del colesterol:
- Derivado del colesterol al que se ha unido covalentemente un ácido graso, convirtiendo el colesterol en una forma más hidrófoba.
- Los ésteres de colesterol se almacenan en el hígado o se transportan en partículas de lipoproteínas secretadas a otros tejidos que utilizan colesterol.
*Glicerofosfolípidos / Fosfoglicéridos
- 2 ácidos grasos unidos por enlace ester al 1° y 2° C + grupo de cabeza muy polar o cargado enlace fosfodiester al 3° C
- Derivados del acido fosfatídico.
- Se nombran según el alcohol polar en el grupo de cabeza.
- Las cargas contribuyen a las propiedades superficiales de mb.
*Esfingolípidos:
- 1 molécula de amino-alcohol de cadena larga esfingosina + acido graso de cadena larga + grupo de cabeza polar (unido por enlace glucosídico o fosfodiéster).
- No contienen glicerol.
- C1,2,3 de esfingosina cumplen rol analogo a glicerol.
*Ceramidas:
- Se une un acido graso por enlace amida al NH2 del C2 se forma este compuesto.
- Unidad estructural fundamental de todos los esfingolípidos.
*Glicoesfingolípidos
*Saponificación
Reacción química entre un ácido graso (o un lípido saponificable, portador de residuos de ácidos grasos) y una base o álcali.
Se obtiene como principal producto la sal de dicho ácido y de dicha base.
Estos compuestos tienen la particularidad de ser anfipáticos, es decir tienen una parte polar y otra apolar (o no polar), con lo cual pueden interactuar con sustancias de propiedades dispares.
Por ejemplo, los jabones son sales de ácidos grasos y metales alcalinos que se obtienen mediante saponificación.
Un lípido saponificable sería todo aquel que esté compuesto por un alcohol unido a uno o varios ácidos grasos (iguales o distintos). Esta unión se realiza mediante un enlace éster, muy difícil de hidrolizar.
*Esterificación
Se denomina esterificación al proceso por el cual se sintetiza un éster. Un éster es un compuesto derivado formalmente de la reacción química entre un oxácido y un alcohol.
Cuando se habla de ésteres se hace alusión a los ésteres de ácidos carboxílicos, substancias cuya estructura es R-COOR', donde R y R' son grupos alquilo. Sin embargo, se pueden formar en principio ésteres de prácticamente todos los oxácidos.
Bibliografía
- Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third Edition, 1999.
- Theory and Practice of Histological Methods, Bancroft & Stevens.
- Lehninger, Principios de Bioquímica, 4° edición, David L. & Michael M.
1) NO esterificados NI amidados
*Ácidos grasos libres:
- Biomolécula orgánica de naturaleza lipídica formada por una larga cadena hidrocarbonada lineal, de número par de átomos de carbono, en cuyo extremo hay un grupo carboxilo.
- Forman parte de los fosfolípidos y glucolípidos que constituyen la bicapa lipídica de la membrana.
*Terpenos:
- Grupo importante de componentes vegetales que tienen un origen biosintético común.
- Estructuras químicas distintas, proceden de la condensación, en N° variable, de unidades isoprénicas.
- El verdadero precursor es el ácido mevalónico, proviene del acetil coenzima A.
*Esteroides (isoprenoides):
- Derivados del núcleo del ciclo pentano perhidrofenantreno que se componen de C, H, O, N y de 4 anillos fusionados de carbono que poseen diversos grupos funcionales y tienen partes hidrofílicas e hidrofóbicas.
- Función reguladora, estructural y hormonal.
- Se sintetizan a partir de colesterol y son lipófilas que atraviesan mb.
2) ESTERIFICADOS
*Grasas neutras (TAG):
- 1 Glicerol (hidroxilos polares) + 3 Ácidos grasos repetidos (carboxilos polares) unidos por enlace ester.
- Son moléculas apolares, hidrofóbicas e insolubles en agua.
- Los triacilglicéridos son el tipo de grasas más abundantes.
*Ceras naturales:
- Ácidos grasos de cadena larga saturados e insaturados (14-36 C) + Alcoholes de cadena larga (16-30 C)
- Son ésteres de los ácidos grasos con alcoholes primarios.
- Punto de fusión alto(60-100°C), repelen el agua y proveen consistencia firme.
*Esteres del colesterol:
- Derivado del colesterol al que se ha unido covalentemente un ácido graso, convirtiendo el colesterol en una forma más hidrófoba.
- Los ésteres de colesterol se almacenan en el hígado o se transportan en partículas de lipoproteínas secretadas a otros tejidos que utilizan colesterol.
*Glicerofosfolípidos / Fosfoglicéridos
- 2 ácidos grasos unidos por enlace ester al 1° y 2° C + grupo de cabeza muy polar o cargado enlace fosfodiester al 3° C
- Derivados del acido fosfatídico.
- Se nombran según el alcohol polar en el grupo de cabeza.
- Las cargas contribuyen a las propiedades superficiales de mb.
*Esfingolípidos:
- 1 molécula de amino-alcohol de cadena larga esfingosina + acido graso de cadena larga + grupo de cabeza polar (unido por enlace glucosídico o fosfodiéster).
- No contienen glicerol.
- C1,2,3 de esfingosina cumplen rol analogo a glicerol.
*Ceramidas:
- Se une un acido graso por enlace amida al NH2 del C2 se forma este compuesto.
- Unidad estructural fundamental de todos los esfingolípidos.
*Glicoesfingolípidos
*Saponificación
Reacción química entre un ácido graso (o un lípido saponificable, portador de residuos de ácidos grasos) y una base o álcali.
Se obtiene como principal producto la sal de dicho ácido y de dicha base.
Estos compuestos tienen la particularidad de ser anfipáticos, es decir tienen una parte polar y otra apolar (o no polar), con lo cual pueden interactuar con sustancias de propiedades dispares.
Por ejemplo, los jabones son sales de ácidos grasos y metales alcalinos que se obtienen mediante saponificación.
Un lípido saponificable sería todo aquel que esté compuesto por un alcohol unido a uno o varios ácidos grasos (iguales o distintos). Esta unión se realiza mediante un enlace éster, muy difícil de hidrolizar.
*Esterificación
Se denomina esterificación al proceso por el cual se sintetiza un éster. Un éster es un compuesto derivado formalmente de la reacción química entre un oxácido y un alcohol.
Cuando se habla de ésteres se hace alusión a los ésteres de ácidos carboxílicos, substancias cuya estructura es R-COOR', donde R y R' son grupos alquilo. Sin embargo, se pueden formar en principio ésteres de prácticamente todos los oxácidos.
Bibliografía
- Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third Edition, 1999.
- Theory and Practice of Histological Methods, Bancroft & Stevens.
- Lehninger, Principios de Bioquímica, 4° edición, David L. & Michael M.
Clasificación de Lípidos
*Clasificacion BIOLOGICA
I) Los lípidos podrían clasificarse como un grupo heterogéneo de substancias con la característica común de ser insoluble en agua y soluble en solventes orgánicos. Se pueden clasificar en: lípidos simples, lípidos compuestos o derivados lipídicos.
*Lípidos simples: esteres o ácidos grasos con alcoholes, e incluyen grasas, aceites y ceras. Las grasas son esteres neutros de glicerol con ácidos grasos que pueden ser saturados o insaturados. Los aceites son similares a las grasas, pero líquidos a Tº ambiente. Las ceras son ésteres de ácidos grasos de cadena larga con alcoholes de alto peso molecular.
*Compuestos lipídicos: usualmente consiste en un ácido graso, un alcohol y uno o más de otros grupos como fósforo o nitrógeno. Estos pueden ser encontrados en cerebro y sistema nervioso central.
*Derivados lipídicos: ácidos grasos que pueden ser originados desde lípidos simples o compuestos por medio de hidrólisis. Colesterol, ácidos biliares, hormonas sexuales y adrenocorticales son ejemplos.
II) Los lípidos son un grupo muy heterogéneo que usualmente se clasifican en dos grupos, atendiendo a que posean en su composición ácidos grasos (lípidos saponificables) o no lo posean (lípidos insaponificables).
*Lípidos Saponificables
Simples: contienen C, H y O.
-Acilglicéridos: grasas (sólidos) y aceites (líquidos a T° ambiente ).
-Céridos: ceras naturales.
+Complejos (lípidos de membrana): contienen en su molécula C, H y O, también puede contener N, P, S u otra biomolécula como un glúcido.
-Fosfolípidos: Fosfoglicéridos y Fosfoesfingolípidos
-Glucolípidos: Cerebrósidos y Gangliósidos
*Lípidos Insaponificables
-Terpenoides, Esteroides y Eicosanoides.
III) Otra clasificacion es segun la funcion que cumplen:
Lípidos de almacenamiento (neutros)
- Triacilgliceroles
Lípidos de membrana (polares)
+Fosfolípidos
- Glicerofosfolípidos
- Esfingolípidos
+ Glucolípidos
- Esfingolípidos
- Galactolípidos (sulfolípidos)
Resumen lípidos de membrana
-Glicerofosfolípidos: regiones hidrofóbicas compuestas por 2 ácidos grasos unidos al glicerol.
-Galactolípidos y sulfolípidos: 2 ácidos grasos esterificados con el glicerol pero carecen del fosfato característico de los fosfolípidos.
-Esfingolípidos: se une un solo acido graso a una amina grasa (esfingosina).
-Esteroles: compuesto por un sistema rígido de 4 anillos hidrocarbonados fusionados.
-Plasmalógenos: lípidos con función éter, en que una de las 2 cadenas acilo esta unida al glicerol por enlace éter (en lugar de éster) y contiene en la cadena doble enlace entre C1 y C2.
*Clasificación HISTOQUIMICA
I) Según Kiernan
1. Ácidos grasos libres
2. Terpenos
3. Esteroides
• Corticiodes
• Androgenos
• Progesterona
4. Grasas neutras
• Mono-, di- o trigliceridos
5. Ceras
6. Esteres de colesterol
7. Fosfogliceridos
• Fosfatidilcolina (Lecitinas)
• Fosfatidil etanolamina (Cefalinas)
• Fosfatidil serina
• Eter fosfatido (plasmalógeno)
• Fosfatidil inositol
• Difosfatidil glicerol
8. Esfingomielina
9. Ceramida
10. Glicolípidos (glicoesfingosidos)
• Cerebrósidos
• Gangliosidos
• Sulfátidos
11. Lípidos conjugados a proteínas
• Proteolípidos
• Lipoproteínas
II) Según su caracter electropolar
I) Los lípidos podrían clasificarse como un grupo heterogéneo de substancias con la característica común de ser insoluble en agua y soluble en solventes orgánicos. Se pueden clasificar en: lípidos simples, lípidos compuestos o derivados lipídicos.
*Lípidos simples: esteres o ácidos grasos con alcoholes, e incluyen grasas, aceites y ceras. Las grasas son esteres neutros de glicerol con ácidos grasos que pueden ser saturados o insaturados. Los aceites son similares a las grasas, pero líquidos a Tº ambiente. Las ceras son ésteres de ácidos grasos de cadena larga con alcoholes de alto peso molecular.
*Compuestos lipídicos: usualmente consiste en un ácido graso, un alcohol y uno o más de otros grupos como fósforo o nitrógeno. Estos pueden ser encontrados en cerebro y sistema nervioso central.
*Derivados lipídicos: ácidos grasos que pueden ser originados desde lípidos simples o compuestos por medio de hidrólisis. Colesterol, ácidos biliares, hormonas sexuales y adrenocorticales son ejemplos.
II) Los lípidos son un grupo muy heterogéneo que usualmente se clasifican en dos grupos, atendiendo a que posean en su composición ácidos grasos (lípidos saponificables) o no lo posean (lípidos insaponificables).
*Lípidos Saponificables
Simples: contienen C, H y O.
-Acilglicéridos: grasas (sólidos) y aceites (líquidos a T° ambiente ).
-Céridos: ceras naturales.
+Complejos (lípidos de membrana): contienen en su molécula C, H y O, también puede contener N, P, S u otra biomolécula como un glúcido.
-Fosfolípidos: Fosfoglicéridos y Fosfoesfingolípidos
-Glucolípidos: Cerebrósidos y Gangliósidos
*Lípidos Insaponificables
-Terpenoides, Esteroides y Eicosanoides.
III) Otra clasificacion es segun la funcion que cumplen:
Lípidos de almacenamiento (neutros)
- Triacilgliceroles
Lípidos de membrana (polares)
+Fosfolípidos
- Glicerofosfolípidos
- Esfingolípidos
+ Glucolípidos
- Esfingolípidos
- Galactolípidos (sulfolípidos)
Resumen lípidos de membrana
-Glicerofosfolípidos: regiones hidrofóbicas compuestas por 2 ácidos grasos unidos al glicerol.
-Galactolípidos y sulfolípidos: 2 ácidos grasos esterificados con el glicerol pero carecen del fosfato característico de los fosfolípidos.
-Esfingolípidos: se une un solo acido graso a una amina grasa (esfingosina).
-Esteroles: compuesto por un sistema rígido de 4 anillos hidrocarbonados fusionados.
-Plasmalógenos: lípidos con función éter, en que una de las 2 cadenas acilo esta unida al glicerol por enlace éter (en lugar de éster) y contiene en la cadena doble enlace entre C1 y C2.
*Clasificación HISTOQUIMICA
Por sus propiedades fisicoquímicas podemos hablar de lípidos que son hidrofóbicos e hidrofílicos.
Los lípidos hidrofílicos son polares y los podemos agrupar en fosfolípidos y glicolípidos. Los fosfolípidos son miscibles en agua, los glicolípidos ácidos (gangliósidos y sulfátidos) y los glicolípidos neutros (cerebrósidos) son moderadamente hidrofílicos.
Los lípidos no conjugados y esteres simples (colesterol y ácidos grasos libres) son preponderantemente NO polares por lo tanto son hidrofóbicos. Ellos son impermeables para agentes acuosos, pero tienen una afinidad para los colorantes organotrópicos.
Los lípidos hidrofílicos son polares y los podemos agrupar en fosfolípidos y glicolípidos. Los fosfolípidos son miscibles en agua, los glicolípidos ácidos (gangliósidos y sulfátidos) y los glicolípidos neutros (cerebrósidos) son moderadamente hidrofílicos.
Los lípidos no conjugados y esteres simples (colesterol y ácidos grasos libres) son preponderantemente NO polares por lo tanto son hidrofóbicos. Ellos son impermeables para agentes acuosos, pero tienen una afinidad para los colorantes organotrópicos.
I) Según Kiernan
1. Ácidos grasos libres
2. Terpenos
3. Esteroides
• Corticiodes
• Androgenos
• Progesterona
4. Grasas neutras
• Mono-, di- o trigliceridos
5. Ceras
6. Esteres de colesterol
7. Fosfogliceridos
• Fosfatidilcolina (Lecitinas)
• Fosfatidil etanolamina (Cefalinas)
• Fosfatidil serina
• Eter fosfatido (plasmalógeno)
• Fosfatidil inositol
• Difosfatidil glicerol
8. Esfingomielina
9. Ceramida
10. Glicolípidos (glicoesfingosidos)
• Cerebrósidos
• Gangliosidos
• Sulfátidos
11. Lípidos conjugados a proteínas
• Proteolípidos
• Lipoproteínas
II) Según su caracter electropolar
Identificación de Lípidos que contienen Colina
Las fosfatidilcolinas son comúnmente conocidas como lecitinas, es un fosfoglicérido unido a colina. Ellas son solubles en todos los solventes lipídicos, excepto la acetona.
La esfingomielina es un fosfolípido que contiene una amida derivada de la esfingosina, una colina y ácidos grasos. Las uniones amidas de la esfingomielina son mas resistentes a la hidrólisis alcalina que las uniones esteres de los fosfolípidos.
*Método Hemateína ácida-Dicromato (DAH)
El principio de cromación fue introducido por Muller (1859), pero Weigert observó que la mielina tiene una gran afinidad por la hematoxilina después de ser tratada con fijadores que contienen cromato. Beker (1946) observó que los métodos de cromación y tinción con hemateína ácida son razonablemente específicos para fosfolípidos que contienen colina o, de acuerdo a Roozemond (1971), por lípidos polares que están en un estado fisicoquímica particular. Interferencia de proteínas pueden ser descartadas por comparación con controles de extracción de lípidos con piridina.
Los cortes por congelación son directamente cromados, y luego tratados con hemateína ácida (hematoxilina, iodato de sodio y ácido acético glacial), obteniéndose un complejo metal-colorante con el cromo de color azul oscuro. Esta técnica ha sido utilizada en combinación con aceite rojo O o sudan rojo, para la demostración de lípidos neutros y fosfolípidos en una misma preparación.
En primera instancia, los cortes son expuestos a una solución de cloruro de calcio y dicromato de calcio, este último probablemente se une covalentemente con enlaces insaturados y con la colina, además reacciona también con grupos hidroxilos adyacentes.
Se podría esperar que los grupos hidroxilos libres del complejo participase en la formación de complejos colorante-metal si el numero de coordinación de la tomo de cromo fuese 6.
*Método Hematoxilina férrica (FeH): Una versión del principio de hematoxilina-metal fue introducido por Elleder & Lojda (1973). Rápida y aparentemente más sensible que la técnica de DAH.
+Método para Esfingomielina
*Método de Hidróxido de sodio-Hematoxilina Férrica/DAH
El mismo método utilizado para fosfolípidos que contiene colina pueden ser empleados específicamente para identificación de esfingomielina. Para ello se debe incubar previamente el tejido en una solución de hidróxido de sodio, para destruir los fosfoglicéridos, dejando intactos los fosfoesfingósidos (esfingomielina), resistentes a la hidrólisis alcalina.
*Método Hemateína ácida-Dicromato (DAH)
El principio de cromación fue introducido por Muller (1859), pero Weigert observó que la mielina tiene una gran afinidad por la hematoxilina después de ser tratada con fijadores que contienen cromato. Beker (1946) observó que los métodos de cromación y tinción con hemateína ácida son razonablemente específicos para fosfolípidos que contienen colina o, de acuerdo a Roozemond (1971), por lípidos polares que están en un estado fisicoquímica particular. Interferencia de proteínas pueden ser descartadas por comparación con controles de extracción de lípidos con piridina.
Los cortes por congelación son directamente cromados, y luego tratados con hemateína ácida (hematoxilina, iodato de sodio y ácido acético glacial), obteniéndose un complejo metal-colorante con el cromo de color azul oscuro. Esta técnica ha sido utilizada en combinación con aceite rojo O o sudan rojo, para la demostración de lípidos neutros y fosfolípidos en una misma preparación.
En primera instancia, los cortes son expuestos a una solución de cloruro de calcio y dicromato de calcio, este último probablemente se une covalentemente con enlaces insaturados y con la colina, además reacciona también con grupos hidroxilos adyacentes.
Se podría esperar que los grupos hidroxilos libres del complejo participase en la formación de complejos colorante-metal si el numero de coordinación de la tomo de cromo fuese 6.
*Método Hematoxilina férrica (FeH): Una versión del principio de hematoxilina-metal fue introducido por Elleder & Lojda (1973). Rápida y aparentemente más sensible que la técnica de DAH.
+Método para Esfingomielina
*Método de Hidróxido de sodio-Hematoxilina Férrica/DAH
El mismo método utilizado para fosfolípidos que contiene colina pueden ser empleados específicamente para identificación de esfingomielina. Para ello se debe incubar previamente el tejido en una solución de hidróxido de sodio, para destruir los fosfoglicéridos, dejando intactos los fosfoesfingósidos (esfingomielina), resistentes a la hidrólisis alcalina.
Identificación de Plasmalógenos
Los plasmalógenos corresponden aprox. al 23% de los glicerofosfolípidos del sistema central humano y se encuentran en las membranas de las células de los nervios y del tejido muscular.
*Método Reacción Plasmalitiva 4
Haye`s (1949) crea un procedimiento específico para plasmalógenos.
Esta técnica usa cloruro de mercurio para hidrolizar la unión éter del plasmalógeno, para producir un aldehído que luego reaccionara con el reactivo de Schiff.
El cloruro de mercurio se añade al doble enlace del vinil (1,2-insaturado) éter:
El producto inicial es un hemiacetal inestable, él que inmediatamente se disocia en alcohol y aldehído:
El aldehído es posteriormente visualizado por tratamiento con el reactivo de Schiff. El átomo de mercurio permanece atacando al carbono 2 del aldehído, esta presencia también puede ser demostrada histoquímicamente.
Protocolo
-Hidrolizar la muestra en cloruro de mercurio 2% por 2 min.
-Lavar con 3 cambios de agua destilada.
-Teñir con R. de Schiff 10 min.
-Lavar en abundante agua 10 min.
-Contrastar con Hx. de Mayer 3 min.
-Lavar y Montar en glicerina.
+Resultados: Plasmalógenos (principalmente fosfatidil-etanolamina) color Magenta.
*Reacción Pseudoplasmal
La reacción “pseudoplasmal” es una reacción Schiff positiva inespecífica, para evitar errores se puede utilizar controles sin tratamiento con cloruro de mercurio o bien utilizar cortes por congelación de tejido no fijado. La fijación en formalina no solo induce reacción pseudoplasmal, sino que además provoca extracción de plasmalógenos. Afortunadamente el cloruro de mercurio actúa como fijador en los tejidos cortados por congelación.
Son fosfoglicéridos en los que el glicerol fosfato tiene unido en el C1 mediante un enlace tipo éter, un alcohol de cadena larga. Comúnmente, la parte polar de los plasmalógenos es etanolamina, colina o serina.
Los plasmalógenos son eter fosfátidos, en estos fosfolípidos una larga cadena alquil esta sumada a uno de los oxígenos de glicerol, dando un éter.
Los plasmalógenos son eter fosfátidos, en estos fosfolípidos una larga cadena alquil esta sumada a uno de los oxígenos de glicerol, dando un éter.
*Método Reacción Plasmal
Haye`s (1949) crea un procedimiento específico para plasmalógenos.
Esta técnica usa cloruro de mercurio para hidrolizar la unión éter del plasmalógeno, para producir un aldehído que luego reaccionara con el reactivo de Schiff.
El cloruro de mercurio se añade al doble enlace del vinil (1,2-insaturado) éter:
El producto inicial es un hemiacetal inestable, él que inmediatamente se disocia en alcohol y aldehído:
El aldehído es posteriormente visualizado por tratamiento con el reactivo de Schiff. El átomo de mercurio permanece atacando al carbono 2 del aldehído, esta presencia también puede ser demostrada histoquímicamente.
Protocolo
-Hidrolizar la muestra en cloruro de mercurio 2% por 2 min.
-Lavar con 3 cambios de agua destilada.
-Teñir con R. de Schiff 10 min.
-Lavar en abundante agua 10 min.
-Contrastar con Hx. de Mayer 3 min.
-Lavar y Montar en glicerina.
+Resultados: Plasmalógenos (principalmente fosfatidil-etanolamina) color Magenta.
*Reacción Pseudoplasmal
La reacción “pseudoplasmal” es una reacción Schiff positiva inespecífica, para evitar errores se puede utilizar controles sin tratamiento con cloruro de mercurio o bien utilizar cortes por congelación de tejido no fijado. La fijación en formalina no solo induce reacción pseudoplasmal, sino que además provoca extracción de plasmalógenos. Afortunadamente el cloruro de mercurio actúa como fijador en los tejidos cortados por congelación.
Identificación de Lípidos insaturados
La presencia de dobles enlaces (grupos etilenos) en las cadenas de ácidos grasos puede ser usada para distinguir entre lípidos saturados e insaturados.
*Método de OTAN (osmium tetroxide-α-naphthylamine)
Tetróxido de osmio: el tetróxido de osmio oxida las uniones -CH=CH- para luego ser reducido a una sustancia negra, probablemente dióxido de osmio. El tetróxido de osmio es soluble tanto en solventes polares como apolares, por lo tanto sirve tanto para identificar lípido hidrofóbicos como hidrofílicos. En cortes por congelación el tetróxido de osmio forma esteres cíclicos con sitios hidrofóbicos e hidrofílicos, por adición, en esta reacción la oxidación ocurre en los átomos de carbono y el osmio es reducido de +8 a +6:
Cuando dos enlaces insaturados son oxidados simultáneamente puede haber uniones cruzadas, formando un diester:
Otro compuesto formado durante la reacción es trióxido de osmio. Este es inestable y dará origen a tetróxido de osmio (soluble) y dióxido de osmio (insoluble):
Se puede diferenciar lípidos insaturados hidrofóbicos de hidrofílicos mediante la utilización de clorato de potasio. El ion clorato oxida el dióxido osmio, formado en las uniones hidrofílicas, a tetróxido de osmio:
Los lípidos insaturados hidrofílicos, de esta forma, permanecen convertidos en esteres de osmio cíclicos, los que pueden tener un color café muy tenue, apenas perceptible. En los sitios hidrofóbicos la precipitación de dióxido de osmio es facilitada, tanto que puede observarse un color negro intenso. Los esteres de lípidos insaturados hidrofílicos pueden ser subsecuentemente coloreados tratando los cortes con α-naphthylamina, que forma un complejo rojo o anaranjado al unirse con el osmio, esta reacción forma la base de la OTAN (osmium tetroxide-α-naphthylamine), método para diferenciar lípidos hidrofóbicos de hidrofílicos.
La reacción de tetróxido de osmio se utiliza para identificar lípidos insaturados más que para diferenciar entre hidrofóbicos de hidrofílicos, puesto que puede presentar resultados erróneos. También se debe tener presente la reacción del tetróxido de osmio con los grupos fenólicos presentes en algunas proteínas, por lo que se hace necesaria la utilización de controles.
*Método de Schiff ultravioleta
Belt & Hayes utilizaron la luz ultravioleta para oxidar los dobles enlaces a aldehídos, para subsecuentemente ser teñidos con el reactivo de Schiff. Este es una alternativa a la utilización de tetróxido de osmio, siendo más económica y no toxica.
Para realizar el mismo método se puede utilizar un tratamiento con Ácido fórmico para la oxidación de los dobles enlaces a aldehídos.
*Método de OTAN (osmium tetroxide-α-naphthylamine)
Tetróxido de osmio: el tetróxido de osmio oxida las uniones -CH=CH- para luego ser reducido a una sustancia negra, probablemente dióxido de osmio. El tetróxido de osmio es soluble tanto en solventes polares como apolares, por lo tanto sirve tanto para identificar lípido hidrofóbicos como hidrofílicos. En cortes por congelación el tetróxido de osmio forma esteres cíclicos con sitios hidrofóbicos e hidrofílicos, por adición, en esta reacción la oxidación ocurre en los átomos de carbono y el osmio es reducido de +8 a +6:
Cuando dos enlaces insaturados son oxidados simultáneamente puede haber uniones cruzadas, formando un diester:
Otro compuesto formado durante la reacción es trióxido de osmio. Este es inestable y dará origen a tetróxido de osmio (soluble) y dióxido de osmio (insoluble):
Se puede diferenciar lípidos insaturados hidrofóbicos de hidrofílicos mediante la utilización de clorato de potasio. El ion clorato oxida el dióxido osmio, formado en las uniones hidrofílicas, a tetróxido de osmio:
Los lípidos insaturados hidrofílicos, de esta forma, permanecen convertidos en esteres de osmio cíclicos, los que pueden tener un color café muy tenue, apenas perceptible. En los sitios hidrofóbicos la precipitación de dióxido de osmio es facilitada, tanto que puede observarse un color negro intenso. Los esteres de lípidos insaturados hidrofílicos pueden ser subsecuentemente coloreados tratando los cortes con α-naphthylamina, que forma un complejo rojo o anaranjado al unirse con el osmio, esta reacción forma la base de la OTAN (osmium tetroxide-α-naphthylamine), método para diferenciar lípidos hidrofóbicos de hidrofílicos.La reacción de tetróxido de osmio se utiliza para identificar lípidos insaturados más que para diferenciar entre hidrofóbicos de hidrofílicos, puesto que puede presentar resultados erróneos. También se debe tener presente la reacción del tetróxido de osmio con los grupos fenólicos presentes en algunas proteínas, por lo que se hace necesaria la utilización de controles.
*Método de Schiff ultravioleta
Belt & Hayes utilizaron la luz ultravioleta para oxidar los dobles enlaces a aldehídos, para subsecuentemente ser teñidos con el reactivo de Schiff. Este es una alternativa a la utilización de tetróxido de osmio, siendo más económica y no toxica.
Para realizar el mismo método se puede utilizar un tratamiento con Ácido fórmico para la oxidación de los dobles enlaces a aldehídos.
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