Los Fosfoglicéridos y Fosfoesfingolípidos son los principales lípidos estructurales de las membranas del tejido nervioso, se encuentra en grandes cantidades en el encéfalo y neuronas.
Fosfatidilcolinas
Las fosfatidilcolinas son comúnmente conocidas como lecitinas, es un fosfoglicérido unido a colina y son solubles en todos los solventes lipídicos, excepto la acetona.
La fosfatidilcolina es uno de los principales constituyentes de las bicapas lipídicas de las membranas celulares.
Junto con las sales biliares, ayuda a la solubilización de los ácidos biliares en la bilis.
La fosfatidilcolina contiene mayoritariamente ácido palmítico o ácido esteárico en la posición del C1. En la posición de C2 contiene ácidos grasos insaturados de 18 carbonos como oleico, linoléico o linolénico.
Las fosfatidilcolinas son comúnmente conocidas como lecitinas, es un fosfoglicérido unido a colina y son solubles en todos los solventes lipídicos, excepto la acetona.
La fosfatidilcolina es uno de los principales constituyentes de las bicapas lipídicas de las membranas celulares.
Junto con las sales biliares, ayuda a la solubilización de los ácidos biliares en la bilis.
La fosfatidilcolina contiene mayoritariamente ácido palmítico o ácido esteárico en la posición del C1. En la posición de C2 contiene ácidos grasos insaturados de 18 carbonos como oleico, linoléico o linolénico.
*Método de Hemateína ácida-dicromato (DAH)
Es la unificación de una serie de técnicas descubiertas por diferentes autores:
-Muller: Cromación (1859)
-Weigert : Mielina posee afinidad por la hematoxilina utiizando fijadores que contienen cromato.
-Beker (1946): Métodos de cromación mas la tinción con hemateína ácida de específicos fosfolípidos que contienen colina.
Metodología Los cortes por congelación son directamente cromados, y luego los fosfoglicéridos son teñidos selectivamente con hemateína ácida (hematoxilina, peryodato de sodio y ácido acético glacial), obteniéndose un complejo metal-colorante con el cromo de color azul oscuro.
En primera instancia, los cortes son expuestos a una solución de cloruro de calcio y dicromato de calcio, este último probablemente se une covalentemente con enlaces insaturados y con la colina, además reacciona también con grupos hidroxilos adyacentes.
Es la unificación de una serie de técnicas descubiertas por diferentes autores:
-Muller: Cromación (1859)
-Weigert : Mielina posee afinidad por la hematoxilina utiizando fijadores que contienen cromato.
-Beker (1946): Métodos de cromación mas la tinción con hemateína ácida de específicos fosfolípidos que contienen colina.
Metodología Los cortes por congelación son directamente cromados, y luego los fosfoglicéridos son teñidos selectivamente con hemateína ácida (hematoxilina, peryodato de sodio y ácido acético glacial), obteniéndose un complejo metal-colorante con el cromo de color azul oscuro.
En primera instancia, los cortes son expuestos a una solución de cloruro de calcio y dicromato de calcio, este último probablemente se une covalentemente con enlaces insaturados y con la colina, además reacciona también con grupos hidroxilos adyacentes.
Esta técnica ha sido utilizada en combinación con aceite rojo O o sudan rojo, para la demostración de lípidos neutros y fosfolípidos en una misma preparación.Protocolo
-Tratar los cortes con solucion dicromato de potasio 5% que contenga cloruro de calcio 1% por 18 hrs a RT o 2 hrs a 37º C.
-Lavar en H2Od 30 min.
-Teñir con Hemateina ácida por 2 hrs. a 37º C.
-Diferenciar en tetraborato de sodio 1 hr.
-Contrastar con verde de metilo (núcleos)
-Lavar y Montar en glicerina.
+Resultados: Lecitinas y Esfingomielinas color Azul oscuro
*Hematoxilina férrica (FeH)
Una versión del principio de hematoxilina-metal fue introducido por Elleder & Lojda (1973). Rápida, simple y aparentemente más sensible que la técnica de DAH
Protocolo
-Fijar en formol-calcio 30 min.
-Lavar en H2Od.
-Teñir con hematoxilina férrica 7 min.
-Lavar en H2Od.
-Sumergir en HCl 0,2 %
-Deshidratar en acetona, aclarar en xilol y montar in DPX.
+Resultados: Fosfolípidos y Núcleos Azula
Cefalinas
La cefalina o fosfatidiletanolamina (PE) es un fosfoglicéridos presente en las membranas celulares, uno de los más abundantes en los tejidos humanos.
Está compuesta por:
- glicerol esterificado,
- hidroxilos 1 y 2 por dos ácidos grasos
- hidroxilo 3 un grupo fosfato que a su vez, se esterifica con el aminoalcohol etanolamina, un derivado del etanol.
-Deshidratar en acetona, aclarar en xilol y montar in DPX.
+Resultados: Fosfolípidos y Núcleos Azula
Cefalinas
La cefalina o fosfatidiletanolamina (PE) es un fosfoglicéridos presente en las membranas celulares, uno de los más abundantes en los tejidos humanos.
Está compuesta por:
- glicerol esterificado,
- hidroxilos 1 y 2 por dos ácidos grasos
- hidroxilo 3 un grupo fosfato que a su vez, se esterifica con el aminoalcohol etanolamina, un derivado del etanol.
*Método Ácido Hidroxamico-Oro
Demostración selectiva de fosfoglicéridos (fosfolípidos basados en glicerol).
La Hidroxilamina (NH2OH) convierte las uniones esteres de los fosfoglicéridos en ácido hidroxamico (R-CO-NH-OH), el que reduce nitrato de plata a plata metálica, finalmente estabilizada con oro, “toning” (tonificación). El ácido Hidroxamico es un agente quelante.
La hidroxilamina (destructiva) es un agente alcalino, tanto ella como sus sales son comúnmente utilizadas como agentes reductores.
Demostración selectiva de fosfoglicéridos (fosfolípidos basados en glicerol).
La Hidroxilamina (NH2OH) convierte las uniones esteres de los fosfoglicéridos en ácido hidroxamico (R-CO-NH-OH), el que reduce nitrato de plata a plata metálica, finalmente estabilizada con oro, “toning” (tonificación). El ácido Hidroxamico es un agente quelante.
La hidroxilamina (destructiva) es un agente alcalino, tanto ella como sus sales son comúnmente utilizadas como agentes reductores.
Protocolo
-Tratar los cortes con hidroxilamina. 20 min.
-Lavar con 3 cambios de agua destilada.
-Tratar con solucion de plata 2 hrs. a RT.
-Lavar con ac. acetico 1% y luego agua destilada.
-Tratar con cloridrato de oro 10 min.
-Lavar en agua destilada.
-Tratar con tiosulfato de sodio 5% por 5 min.
-Montar en glicerina.
+Resultados: Cefalinas moradas.
Esfingomielina
Las esfingomielinas son esfingolípidos que se hallan presentes en las membranas plasmáticas de las células animales, en la vaina de mielina que recubre y aísla los axones de las neuronas mielinizadas.
Deriva de la esfingosina, que es un aminoalcohol que contiene una larga cadena hidrocarbonada insaturada.
-Tratar los cortes con hidroxilamina. 20 min.
-Lavar con 3 cambios de agua destilada.
-Tratar con solucion de plata 2 hrs. a RT.
-Lavar con ac. acetico 1% y luego agua destilada.
-Tratar con cloridrato de oro 10 min.
-Lavar en agua destilada.
-Tratar con tiosulfato de sodio 5% por 5 min.
-Montar en glicerina.
+Resultados: Cefalinas moradas.
Esfingomielina
Las esfingomielinas son esfingolípidos que se hallan presentes en las membranas plasmáticas de las células animales, en la vaina de mielina que recubre y aísla los axones de las neuronas mielinizadas.
Deriva de la esfingosina, que es un aminoalcohol que contiene una larga cadena hidrocarbonada insaturada.
Los esfingolípidos están formados por tres componentes estructurales principales:
-una cadena larga, normalmente la esfingosina
-un ácido graso de longitud variable unido al carbono 2 de la cadena base
-diversas cabezas polares unidas al carbono 1
-una cadena larga, normalmente la esfingosina
-un ácido graso de longitud variable unido al carbono 2 de la cadena base
-diversas cabezas polares unidas al carbono 1
*Método de Hidróxido de sodio-FeH/DAH
El mismo método utilizado para fosfolípidos que contiene colina pueden ser empleados específicamente para identificación de esfingomielina.
Para ello se debe incubar previamente el tejido en una solución de hidróxido de sodio, para destruir los fosfoglicéridos, dejando intactos los fosfoesfingósidos (esfingomielina), resistentes a la hidrólisis alcalina.
Protocolo
-Tratar los cortes con hidróxido de sodio 2M por 1 hr.
-Lavar en abundante agua.
-Lavar con ác. acético glacial 5 s.
-Seguir con el protocolo de tinción con Hematoxilina férrica (FeH) o DAH
+Resultados: Esfingomielinas Azul.
El mismo método utilizado para fosfolípidos que contiene colina pueden ser empleados específicamente para identificación de esfingomielina.
Para ello se debe incubar previamente el tejido en una solución de hidróxido de sodio, para destruir los fosfoglicéridos, dejando intactos los fosfoesfingósidos (esfingomielina), resistentes a la hidrólisis alcalina.
Protocolo
-Tratar los cortes con hidróxido de sodio 2M por 1 hr.
-Lavar en abundante agua.
-Lavar con ác. acético glacial 5 s.
-Seguir con el protocolo de tinción con Hematoxilina férrica (FeH) o DAH
+Resultados: Esfingomielinas Azul.
Bibliografía
-J. A. Kiernan. “Histological and Histochemical methods. Theory and Practice”. Third edition. pp 247 – 260.
-Bancroft and Gamble. “Theory and practice of Histological techniques”. Ed. 2001. pp 214 – 220.
