* Métodos para identificación de bacterias GRAM (+) y (-)
+ Método de Gram para cortes
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Cristal de violeta (2 g) + Alcohol 95% (20 mL)
b) Oxalato de amonio (800 mg) + Agua destilada (80 mL)
c) Yodo de Weigert: Sol. Yoduro de potasio (2 g) + Yodo (1 g) + agua destilada (100 mL)
d) Safranina al 0,5% (100 mL)
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinados e hidratados hasta agua destilada, se colocaron 30 seg. en solución cristal violeta de trabajo (mezcla sol. a y b) y se lavaron brevemente en agua destilada. Se colocaron 2 min en sol. Yodo de Weigert, decoloraron con alcohol-acetona por 10-15 seg controlando que no se pierda la coloración de las bacterias. Se lavaron en agua corriente, después en agua destilada y se realizo una tinción de contraste con safranina por 15-30 segundos. Se deshidrato por 10-15 seg por goteo con acetona, se aclararon con Xilol y montaron en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son bacterias G(+) azul negro y núcleos rojo oscuro, bacterias G(-) rojo y citoplasma rosado.
- Bacilos alcohol-acido resistentes (BAAR)
+ Método de Ziehl Neelsen
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Carbol fucsina: Fucsina básica (1 g) + Alcohol absoluto (10 mL) + H2O Fenicada 5% (90 mL)
b) Alcohol clorhídrico 1% o 2 cc de Acido clorhídrico + 100 mL de Alcohol absoluto
c) Azul de metileno
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinados los cortes e hidratados hasta agua destilada, se realizo la tinción con Carbol fucsina (sol. a) colocando un trozo de papel filtro húmedo sobre el tejido, agregando el colorante y calentando la lamina al mechero pasándolo rápidamente sobre la lámina hasta que desprendió vapores. Se lavo con agua corrientes, diferencio en alcohol clorhídrico (sol. b) hasta que no se desprendiera el colorante (20 seg a varios minutos) y se lavaron en agua corriente durante 2-3 minutos. Después se realizo una tinción de contraste con azul de metileno al 1% por 3 segundos a RT, lavo con agua corriente, dejo secar al aire y monto en resina.
- Los resultados esperados para este método son BAAR rojos y núcleos azules.
* Método para identificación de HONGOS
+ Método de Grocott
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Acido crómico al 5%; b) Metabisulfito de Na 1%; c) Solución de Cloruro de oro 0,2%; d) Tiosulfato de Na 5%; Verde luz 1% en Acido acético 0,1%; f) Acido acético 0,1%; g) Solución de Metenamina de plata: Hexametilenetetramina 3% (50 mL) + Nitrato de plata 5% (2,5 mL) + Borax a saturación (5 mL).
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinada la muestra e hidratada en agua destilada se colocaron los cortes a oxidar en acido crómico por 1 hr. a temperatura ambiente y en oscuridad. Se lavaron bien con agua, pasaron por agua destilada, retiró el exceso de acido crómico colocando los cortes por 1 minuto en una solución de Metabisulfito de Na, se lavaron bien en agua corriente y pasaron por tres cambios de agua destilada. A baño María se calentó la solución de Metenamina de plata hasta aprox. 56-60°C en microondas a 100W por 1 min y 30 seg tomando la temperatura con un termómetro. Los cortes se colocaron en la solución calentada y se pusieron en microondas a potencia de 40W calentándola por 1 min. Se dejaron reposar hasta que los cortes se observaron de un color café parduzco controlando al microscopio y se pasaron por agua destilada tibia por 3 cambios. Se pasaron por solución de Cloruro de Au controlando al microscopio hasta que las hifas de los hongos tomaron una coloración negra. Se lavaron con agua destilada por dos cambios, colocaron en solución de Tiosulfato de Na 5% por 1 minuto, lavaron varias veces con agua destilada, deshidrataron, aclararon y montaron los cortes en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son que las paredes de los hongos se observen negras.
*Método para identificación de HELICOBACTER PILORY
+ Método de Elzimaity
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Solución Carbol fucsina: fucsina básica (1g) + Alcohol abs. (10mL) + Fenol 5% en agua dest. (100mL)
b) Solución Alcian blue 1% en Acido acético 3% a pH 2,5
c) Hematoxilina de Harris
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinada la muestra e hidratada en agua destilada, se colocaron en solución de Carbol fucsina, en la lámina, por 1 minuto y lavaron en agua corriente por 1 minuto controlando al microscopio. Se pasaron por agua destilada, colocaron los cortes en solución de Alcian blue 1% por 1 minuto, lavaron en agua corriente por 2 minutos controlando al microscopio. Se pasaron por agua destilada, tiñeron los cortes con Hematoxilina de Harris por 10 minutos, lavaron en agua corriente por 10 minutos y pasaron por agua destilada. Finalmente se tiñeron por 10-30 segundos en Eosina acuosa, lavaron rápidamente en agua destilada, deshidrataron, aclararon y montaron en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son núcleos azules, citoplasma rosado, mucopolisacáridos ácidos calipso y Helicobacter pilory rojos.
+ Wartin-Starry modificado para microondas
- Para este método se utilizan los reactivos:
*Solución stock acido acético-glicina (AAG): Glicina (2,4 gr) + Acido acético glacial (0,3 mL) + Agua destilada (100 mL) a pH 3,9 aprox.
1. Solución de trabajo acido acético-glicina: AAG (1 mL) + Agua destilada (100 mL) a pH 4,2 aprox.
*Solución nitrato de plata 2%: Nitrato de plata (0,2 gr) + AAG (10 mL)
*Solución gelatina 4%: Gelatina (1 gr) + AAG (25 mL) disolviendo en calor 56-60°
*Solución Hidroquinona (0,015 gr) + AAG (15 mL)
2. Revelador Hidroquinona-Gelatina-Nitrato de plata: AgNO3 2% (10mL) + Gelatina 4% (25mL) + Hidroquinona 0,1% (15mL)
3. Solución nitrato de plata 0,5%: AgNO3 (0,2 g) + AAG (40 mL) preparado al momento de usar.
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinada la muestra e hidratada en agua destilada se pasaron los cortes por aguas destiladas y solución AAG de trabajo. Luego se pusieron los portas en solución de nitrato de plata 0,5%, microondearon (60W) por 4 minutos aprox. y dejaron los cortes en solución caliente a 80°C por 2 min. Se pusieron los portas en solución reveladora a 56-60°C, hasta que adquirieron un color café grisáceo, lavaron en agua destilada caliente (60°C), después en agua destilada 3 veces, deshidrataron, aclararon y montaron en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son núcleos café, Helicobacter pilory y bacterias negras.
*Manual de Laboratorio de Técnica Histológica (Guía de trabajos y datos útiles para el alumno), Profesor Marco Antonio Loyola Brambilla, Mención de Morfofisiopatología y Citodiagnóstico, Carrera Tecnología Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción.
+ Método de Gram para cortes
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Cristal de violeta (2 g) + Alcohol 95% (20 mL)
b) Oxalato de amonio (800 mg) + Agua destilada (80 mL)
c) Yodo de Weigert: Sol. Yoduro de potasio (2 g) + Yodo (1 g) + agua destilada (100 mL)
d) Safranina al 0,5% (100 mL)
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinados e hidratados hasta agua destilada, se colocaron 30 seg. en solución cristal violeta de trabajo (mezcla sol. a y b) y se lavaron brevemente en agua destilada. Se colocaron 2 min en sol. Yodo de Weigert, decoloraron con alcohol-acetona por 10-15 seg controlando que no se pierda la coloración de las bacterias. Se lavaron en agua corriente, después en agua destilada y se realizo una tinción de contraste con safranina por 15-30 segundos. Se deshidrato por 10-15 seg por goteo con acetona, se aclararon con Xilol y montaron en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son bacterias G(+) azul negro y núcleos rojo oscuro, bacterias G(-) rojo y citoplasma rosado.
- Bacilos alcohol-acido resistentes (BAAR)
+ Método de Ziehl Neelsen
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Carbol fucsina: Fucsina básica (1 g) + Alcohol absoluto (10 mL) + H2O Fenicada 5% (90 mL)
b) Alcohol clorhídrico 1% o 2 cc de Acido clorhídrico + 100 mL de Alcohol absoluto
c) Azul de metileno
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinados los cortes e hidratados hasta agua destilada, se realizo la tinción con Carbol fucsina (sol. a) colocando un trozo de papel filtro húmedo sobre el tejido, agregando el colorante y calentando la lamina al mechero pasándolo rápidamente sobre la lámina hasta que desprendió vapores. Se lavo con agua corrientes, diferencio en alcohol clorhídrico (sol. b) hasta que no se desprendiera el colorante (20 seg a varios minutos) y se lavaron en agua corriente durante 2-3 minutos. Después se realizo una tinción de contraste con azul de metileno al 1% por 3 segundos a RT, lavo con agua corriente, dejo secar al aire y monto en resina.
- Los resultados esperados para este método son BAAR rojos y núcleos azules.
* Método para identificación de HONGOS
+ Método de Grocott
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Acido crómico al 5%; b) Metabisulfito de Na 1%; c) Solución de Cloruro de oro 0,2%; d) Tiosulfato de Na 5%; Verde luz 1% en Acido acético 0,1%; f) Acido acético 0,1%; g) Solución de Metenamina de plata: Hexametilenetetramina 3% (50 mL) + Nitrato de plata 5% (2,5 mL) + Borax a saturación (5 mL).
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinada la muestra e hidratada en agua destilada se colocaron los cortes a oxidar en acido crómico por 1 hr. a temperatura ambiente y en oscuridad. Se lavaron bien con agua, pasaron por agua destilada, retiró el exceso de acido crómico colocando los cortes por 1 minuto en una solución de Metabisulfito de Na, se lavaron bien en agua corriente y pasaron por tres cambios de agua destilada. A baño María se calentó la solución de Metenamina de plata hasta aprox. 56-60°C en microondas a 100W por 1 min y 30 seg tomando la temperatura con un termómetro. Los cortes se colocaron en la solución calentada y se pusieron en microondas a potencia de 40W calentándola por 1 min. Se dejaron reposar hasta que los cortes se observaron de un color café parduzco controlando al microscopio y se pasaron por agua destilada tibia por 3 cambios. Se pasaron por solución de Cloruro de Au controlando al microscopio hasta que las hifas de los hongos tomaron una coloración negra. Se lavaron con agua destilada por dos cambios, colocaron en solución de Tiosulfato de Na 5% por 1 minuto, lavaron varias veces con agua destilada, deshidrataron, aclararon y montaron los cortes en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son que las paredes de los hongos se observen negras.
*Método para identificación de HELICOBACTER PILORY
+ Método de Elzimaity
- Para este método se utilizan los reactivos:
a) Solución Carbol fucsina: fucsina básica (1g) + Alcohol abs. (10mL) + Fenol 5% en agua dest. (100mL)
b) Solución Alcian blue 1% en Acido acético 3% a pH 2,5
c) Hematoxilina de Harris
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinada la muestra e hidratada en agua destilada, se colocaron en solución de Carbol fucsina, en la lámina, por 1 minuto y lavaron en agua corriente por 1 minuto controlando al microscopio. Se pasaron por agua destilada, colocaron los cortes en solución de Alcian blue 1% por 1 minuto, lavaron en agua corriente por 2 minutos controlando al microscopio. Se pasaron por agua destilada, tiñeron los cortes con Hematoxilina de Harris por 10 minutos, lavaron en agua corriente por 10 minutos y pasaron por agua destilada. Finalmente se tiñeron por 10-30 segundos en Eosina acuosa, lavaron rápidamente en agua destilada, deshidrataron, aclararon y montaron en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son núcleos azules, citoplasma rosado, mucopolisacáridos ácidos calipso y Helicobacter pilory rojos.
+ Wartin-Starry modificado para microondas
- Para este método se utilizan los reactivos:
*Solución stock acido acético-glicina (AAG): Glicina (2,4 gr) + Acido acético glacial (0,3 mL) + Agua destilada (100 mL) a pH 3,9 aprox.
1. Solución de trabajo acido acético-glicina: AAG (1 mL) + Agua destilada (100 mL) a pH 4,2 aprox.
*Solución nitrato de plata 2%: Nitrato de plata (0,2 gr) + AAG (10 mL)
*Solución gelatina 4%: Gelatina (1 gr) + AAG (25 mL) disolviendo en calor 56-60°
*Solución Hidroquinona (0,015 gr) + AAG (15 mL)
2. Revelador Hidroquinona-Gelatina-Nitrato de plata: AgNO3 2% (10mL) + Gelatina 4% (25mL) + Hidroquinona 0,1% (15mL)
3. Solución nitrato de plata 0,5%: AgNO3 (0,2 g) + AAG (40 mL) preparado al momento de usar.
- El procedimiento de este método fue el siguiente:
Una vez desparafinada la muestra e hidratada en agua destilada se pasaron los cortes por aguas destiladas y solución AAG de trabajo. Luego se pusieron los portas en solución de nitrato de plata 0,5%, microondearon (60W) por 4 minutos aprox. y dejaron los cortes en solución caliente a 80°C por 2 min. Se pusieron los portas en solución reveladora a 56-60°C, hasta que adquirieron un color café grisáceo, lavaron en agua destilada caliente (60°C), después en agua destilada 3 veces, deshidrataron, aclararon y montaron en resina sintética.
- Los resultados esperados para este método son núcleos café, Helicobacter pilory y bacterias negras.
*Manual de Laboratorio de Técnica Histológica (Guía de trabajos y datos útiles para el alumno), Profesor Marco Antonio Loyola Brambilla, Mención de Morfofisiopatología y Citodiagnóstico, Carrera Tecnología Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción.
