1. Marcar láminas con cada anticuerpo a determinar.
2. Colocar controles correspondientes a cada anticuerpo.
3. Separa láminas según los siguientes criterios (orden alfabético Ac y buffer de recuperación).
4. Preparar diluciones necesarias (Este paso se hace una vez que las láminas se colocan en la vaporera a recuperar).
5. Desparafinar e hidratar las láminas hasta agua destilada.
6. Realizar bloqueo de Peroxidasa endógena, con H2O2 a RT por 5 min (menos en una lámina).
7. Lavar las láminas con agua corriente (2 min) y colocarlas en agua destilada.
8. Realizar recuperación antigénica.
9. Antes de realizar el siguiente paso, se debe marcar en cada lámina un circulo alrededor del tejido, con lápiz hidrofóbico.
10. Aplicar Ac 1° y reemplazar por buffer (en caso de Control negativo) y colocar bandeja de incubación con las láminas en el refrigerador por 18 horas a 4°C.
11. Retirar cámara del refrigerador y dejar a RT por 20 min.
12. Retirar el anticuerpo con bomba de aspiración, y lavar a la vez, cuidadosamente, con buffer PBS (dos cambios de 2 minutos cada uno).
13. Colocar Anticuerpo secundario , por 15 min a 37ºC (100 ul c/ lámina).
14. Lavar con buffer PBS (2 cambios de 2 minutos cada uno).
15. Colocar HRP por 15 minutos a 37ºC (100 ul cada lámina).
16. Lavar con buffer PBS (2 cambios de 2 minutos cada uno).
17. Colocar cromógeno 100 ul cada lámina (DAB ) por 3 - 5 min a RT y protegido de la luz (controlar intensidad de reacción a los 2 min).
18. Lavar con agua destilada.
19. Realizar contraste de los núcleos con hematoxilina (20 seg) Controlar al microscopio.
20. Lavar y azular núcleos.
21. Deshidratar, aclarar y montar con resina.
Protocolo obtenido de la Guía de Laboratorio de las prácticas de Inmunohistoquímica de la carrera Tecnología Médica mención Morfofiopatología y Citodiagnóstico de la Universidad de Concepción el año 2009 de la profesora TM Patricia Grez.
2. Colocar controles correspondientes a cada anticuerpo.
3. Separa láminas según los siguientes criterios (orden alfabético Ac y buffer de recuperación).
4. Preparar diluciones necesarias (Este paso se hace una vez que las láminas se colocan en la vaporera a recuperar).
5. Desparafinar e hidratar las láminas hasta agua destilada.
6. Realizar bloqueo de Peroxidasa endógena, con H2O2 a RT por 5 min (menos en una lámina).
7. Lavar las láminas con agua corriente (2 min) y colocarlas en agua destilada.
8. Realizar recuperación antigénica.
9. Antes de realizar el siguiente paso, se debe marcar en cada lámina un circulo alrededor del tejido, con lápiz hidrofóbico.
10. Aplicar Ac 1° y reemplazar por buffer (en caso de Control negativo) y colocar bandeja de incubación con las láminas en el refrigerador por 18 horas a 4°C.
11. Retirar cámara del refrigerador y dejar a RT por 20 min.
12. Retirar el anticuerpo con bomba de aspiración, y lavar a la vez, cuidadosamente, con buffer PBS (dos cambios de 2 minutos cada uno).
13. Colocar Anticuerpo secundario , por 15 min a 37ºC (100 ul c/ lámina).
14. Lavar con buffer PBS (2 cambios de 2 minutos cada uno).
15. Colocar HRP por 15 minutos a 37ºC (100 ul cada lámina).
16. Lavar con buffer PBS (2 cambios de 2 minutos cada uno).
17. Colocar cromógeno 100 ul cada lámina (DAB ) por 3 - 5 min a RT y protegido de la luz (controlar intensidad de reacción a los 2 min).
18. Lavar con agua destilada.
19. Realizar contraste de los núcleos con hematoxilina (20 seg) Controlar al microscopio.
20. Lavar y azular núcleos.
21. Deshidratar, aclarar y montar con resina.
Protocolo obtenido de la Guía de Laboratorio de las prácticas de Inmunohistoquímica de la carrera Tecnología Médica mención Morfofiopatología y Citodiagnóstico de la Universidad de Concepción el año 2009 de la profesora TM Patricia Grez.
