*Método de Lieberman-Schultz
(modificado por Lewis y Lobban, 1961)
El colesterol es oxidado con alumbre de hierro, seguido con una mezcla en partes iguales de ácido sulfúrico y ácido acético, dando un color azul-verde con el colesterol libre y sus ésteres. Esta técnica es específica para colesterol, pero poco sensible, además es poco estable, y debe ser observada inmediatamente o por lo menos antes de 60 min., la marca o tinción es algo borrosa, de difícil localización y suelen quedar burbujas en los preparados.
*Método Ácido perclórico-naftoquinona (PAN)
Es un método preferido por su sensibilidad. Los cortes son calentados en una solución de ácido perclórico, 1,2-naftoquinona-4-ácido sulfónico, formaldehído y etanol. Se piensa que en una primera etapa, el ácido perclórico convierte el colesterol en un conjugado diana:
En la próxima fase del método, el reactivo diana reacciona con 1,2-naftoquinona-4-ácido sulfónico para formar un compuesto azul. La química de la segunda reacción y la naturaleza del compuesto formado son aun desconocidas, al igual que el rol que juegan el etanol y el formaldehído contenidos en la solución.
Se debe hacer hincapié en que el mencionado método es ineficaz a menos que el colesterol sea oxidado con agentes químicos como el alumbre de fierro, o por exposición prolongada al oxígeno atmosférico (aire).
*Método Digitonina-PAN para colesterol libre
El colesterol libre podría ser distinguido de los esteres por un tratamiento previo de precipitación con digitonina. La digitonina es un esteroide glicosilado, proveniente de una planta, forma con el colesterol un producto que es insoluble en acetona fría. Los esteres de colesterol permanecen solubles en acetona fría, al igual que otros lípidos hidrofóbicos. En resumen, este método consiste en una precipitación del colesterol libre con digitonina, seguida de una extracción de los esteres de colesterol y otros lípidos hidrofóbicos con acetona fría, y finalmente, la realización del método de PAN descrito anteriormente.
Una innovación interesante en la histoquímica del colesterol involucra la utilización de enzimas. Estos métodos constan de dos etapas: primero los esteres de colesterol son hidrolizados por una colesterol esterasa en esterol libre, para que luego, en una segunda etapa, el colesterol sea oxidado por una colesterol oxidasa, liberando peroxido de hidrógeno, el que reacciona simultáneamente con diaminobenzidina (DAB), para general un precipitado pardo e insoluble en el sitio del colesterol.
(modificado por Lewis y Lobban, 1961)
El colesterol es oxidado con alumbre de hierro, seguido con una mezcla en partes iguales de ácido sulfúrico y ácido acético, dando un color azul-verde con el colesterol libre y sus ésteres. Esta técnica es específica para colesterol, pero poco sensible, además es poco estable, y debe ser observada inmediatamente o por lo menos antes de 60 min., la marca o tinción es algo borrosa, de difícil localización y suelen quedar burbujas en los preparados.
*Método Ácido perclórico-naftoquinona (PAN)
Es un método preferido por su sensibilidad. Los cortes son calentados en una solución de ácido perclórico, 1,2-naftoquinona-4-ácido sulfónico, formaldehído y etanol. Se piensa que en una primera etapa, el ácido perclórico convierte el colesterol en un conjugado diana:
En la próxima fase del método, el reactivo diana reacciona con 1,2-naftoquinona-4-ácido sulfónico para formar un compuesto azul. La química de la segunda reacción y la naturaleza del compuesto formado son aun desconocidas, al igual que el rol que juegan el etanol y el formaldehído contenidos en la solución.Se debe hacer hincapié en que el mencionado método es ineficaz a menos que el colesterol sea oxidado con agentes químicos como el alumbre de fierro, o por exposición prolongada al oxígeno atmosférico (aire).
*Método Digitonina-PAN para colesterol libre
El colesterol libre podría ser distinguido de los esteres por un tratamiento previo de precipitación con digitonina. La digitonina es un esteroide glicosilado, proveniente de una planta, forma con el colesterol un producto que es insoluble en acetona fría. Los esteres de colesterol permanecen solubles en acetona fría, al igual que otros lípidos hidrofóbicos. En resumen, este método consiste en una precipitación del colesterol libre con digitonina, seguida de una extracción de los esteres de colesterol y otros lípidos hidrofóbicos con acetona fría, y finalmente, la realización del método de PAN descrito anteriormente.
Una innovación interesante en la histoquímica del colesterol involucra la utilización de enzimas. Estos métodos constan de dos etapas: primero los esteres de colesterol son hidrolizados por una colesterol esterasa en esterol libre, para que luego, en una segunda etapa, el colesterol sea oxidado por una colesterol oxidasa, liberando peroxido de hidrógeno, el que reacciona simultáneamente con diaminobenzidina (DAB), para general un precipitado pardo e insoluble en el sitio del colesterol.
