Se basa en la capacidad de los ácidos grasos libres de formar sales (jabones) insolubles en agua, por unión a iones metálicos.
Este método comienza con una desaponificación de jabones de calcio, existentes en el tejido principalmente el fijado con formol-calcio, con HCl 1M, para posteriormente generar jabones de cobre por inmersión en acetato de cobre 0.005%. El pre-tratamiento con HCl también disolvería fosfatos y carbonatos de calcio. Una incubación con EDTA pH 7.0 permite quelar los iones, entre ellos los excedentes de cobre, disminuyendo el background. Los jabones de cobre son visualizados por acción del ácido rubeánico (dithiooamida) que posee la siguiente estructura:
El ácido rubeánico es un agente quelante que forma un complejo verde oscuro con el cobre (como ion cúprico, estado de oxidación +2). El complejo con el Cu se cree que tiene una estructura polimérica:
La dithiooxamide se combina solo con iones cúpricos. Un agente que forma un complejo coloreado con el ion cuproso es el p-dimethylaminobenzylidine rhodanine. Este se puede utilizar en lugar del ácido rubeánico, obteniéndose un producto rojo.Tanto el ácido rubeánico como el p-dimethylaminobenzylidine rhodanine son igualmente sensibles como métodos histoquímicos para la identificación de cobre, pero solo este último da una intensidad de coloración proporcional a la concentración del metal en el tejido.
