El fundamento de este método se basa en la identificación altamente específica de ácidos nucleicos del ADN a partir del reconocimiento de los grupos aldehídos de la pentosa (azúcar). Para esto se realizan 2 pasos fundamentales:
1) Hidrólisis ácida:
Se utiliza para romper los puentes de hidrogeno que unen a la doble hélice, mediante la desnaturalización de la cadena. Para esto se utiliza ácido clorhídrico (HCl), que es el componente reactivo mas critico del método, controlando la concentración del ácido, temperatura y tiempo, que depende del tipo de tejido (compactación de cromatina) y fijador empleado.
Durante la hidrólisis ácida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se pierde del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, por lo que, este material no reacción posteriormente con el reactivo de Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las bases púricas (A y G) de los residuos de deoxiribosa (depurinización) formando ácido apurínico y generando grupos aldehído (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base nitrogenada.
Los grupos aldehídos liberados por la hidrólisis de Feulgen son teñidos con reactivo de Schiff. Cualquier grupo aldehído libre endógeno y preexistente producido por el fijador (ej. glutaraldehído), tejido elástico inmaduro o algunos lípidos son removidos tratando el tejido con boro hidrato de sodio antes de ser teñido.
Los resultados son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teñido color fucsia y fondo incoloro, en el caso de que de que se utilice una coloración de contraste como el Fast Green FCF el fondo sería verde.
Para realizar una extracción química de los ácidos nucleicos se aplica un tratamiento para remover, RNA pero no DNA, con una solución de ácido perclórico (HCIO4) al 10% a 4ªC por toda la noche. La selectividad de este proceso, de extracción química, se basa en la catálisis por ácidos de la hidrólisis de las uniones entre pentosas y bases, y entre pentosas y ácido fosforito. En el caso del RNA las uniones fosfato-ester son mas lábiles a la hidrólisis que en el DNA, por lo que, se extraen mas fácilmente y de forma selectiva, mientras simultáneamente remueve bases púricas y pirimidicas del DNA permitiendo ser teñidos sus ácidos nucleicos posteriormente con reactivo de Schiff.
Solamente el método de Feulgen puede considerarse estequiométrico en donde es posible observar una intensidad de coloración proporcional a la concentración de DNA, por lo que es posible determinar cuantitativamente el DNA presente en el núcleo de las células, lo que se aplica en patología a la cuantificación de células que contienen cantidades anormales de DNA en tumores malignos. La hidrólisis ácida rompe los puentes de hidrógeno separando las hebras de DNA produciendo una depurinización, por lo tanto, para obtener un mayor número de grupos aldehído reactivos, identificables con reactivo de Schiff, es necesario realizar una hidrólisis que libere mayor cantidad de bases púricas.
Ejemplo de Curva de hidrólisis para Feulgen obtenida experimentalmente
Análisis de la curva de hidrólisis:
*Tiempo 0 min.: la muestra de tejido se encuentra con una intensidad de coloración prácticamente nula ya que el DNA no posee una cantidad grupos aldehídos expuestos suficiente como para reaccionar con reactivo de Schiff, y producir color, porque no fue sometido a un tratamiento de hidrólisis ácida que produzca depurinización con una regeneración de grupos aldehídos.
*Tiempo 0’ a 60’ (ascenso): durante los primeros 60’ en que el tejido a sido expuesto a la hidrólisis ácida se han ido rompiendo los puentes de hidrogeno, que unen la doble hélice, progresivamente liberando bases púricas generando grupos aldehídos (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba la base nitrogenada. A medida que aumenta el tiempo de hidrólisis se produce, por la depurinización, una mayor cantidad de grupos aldehídos expuestos que por reacción con el reactivo de Schiff, generan una coloración que se va haciendo mas intensa a medida que el tiempo de exposición al ácido es mayor.
*Tiempo 60’ a 90’ (meseta): durante estos 30’ de hidrólisis ácida se han liberado todas las bases púricas y pirimidicas del tejido sin producir una despolimerización del DNA, por lo que, se observa la máxima intensidad de coloración, con tonalidad fucsia, de los ácidos nucleicos.
*Tiempo 90’ a 120’ (descenso): durante estos 30’, en los que se trabajo, se pudo observar que el tiempo al que a sido expuesto el tejido al ácido clorhídrico a sido excesivo, por lo que, la hidrólisis ácida rompe las uniones tipo ester de la pentosa con los fosfatos en los C3 y C5 de forma progresiva hasta producir una despolimerización del DNA.
Bibliografía: Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third Edition, 1999.
1) Hidrólisis ácida:
Se utiliza para romper los puentes de hidrogeno que unen a la doble hélice, mediante la desnaturalización de la cadena. Para esto se utiliza ácido clorhídrico (HCl), que es el componente reactivo mas critico del método, controlando la concentración del ácido, temperatura y tiempo, que depende del tipo de tejido (compactación de cromatina) y fijador empleado.
Durante la hidrólisis ácida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se pierde del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, por lo que, este material no reacción posteriormente con el reactivo de Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las bases púricas (A y G) de los residuos de deoxiribosa (depurinización) formando ácido apurínico y generando grupos aldehído (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base nitrogenada.
Fenomenos moleculares de la exposicion del DNA a la Hidrólisis Acida
2) Tinción con Reactivo de Schiff:
Este es un paso crítico por lo que hay que tener en cuenta las variables de tiempo de exposición a la hidrólisis acida, pH ([ H+]) al que se lleve a cabo la reacción, temperatura, el fijador utilizado en el tejido y el grado de compactación de la cromatina que depende de la naturaleza del tejido.
Los grupos aldehídos liberados por la hidrólisis de Feulgen son teñidos con reactivo de Schiff. Cualquier grupo aldehído libre endógeno y preexistente producido por el fijador (ej. glutaraldehído), tejido elástico inmaduro o algunos lípidos son removidos tratando el tejido con boro hidrato de sodio antes de ser teñido.
Los resultados son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teñido color fucsia y fondo incoloro, en el caso de que de que se utilice una coloración de contraste como el Fast Green FCF el fondo sería verde.
Curva de Feulguen de Intensidad de Coloración en un rango de tiempo al tratamiento con Hidrólisis Acida de las muestras
Para realizar una extracción química de los ácidos nucleicos se aplica un tratamiento para remover, RNA pero no DNA, con una solución de ácido perclórico (HCIO4) al 10% a 4ªC por toda la noche. La selectividad de este proceso, de extracción química, se basa en la catálisis por ácidos de la hidrólisis de las uniones entre pentosas y bases, y entre pentosas y ácido fosforito. En el caso del RNA las uniones fosfato-ester son mas lábiles a la hidrólisis que en el DNA, por lo que, se extraen mas fácilmente y de forma selectiva, mientras simultáneamente remueve bases púricas y pirimidicas del DNA permitiendo ser teñidos sus ácidos nucleicos posteriormente con reactivo de Schiff.
Solamente el método de Feulgen puede considerarse estequiométrico en donde es posible observar una intensidad de coloración proporcional a la concentración de DNA, por lo que es posible determinar cuantitativamente el DNA presente en el núcleo de las células, lo que se aplica en patología a la cuantificación de células que contienen cantidades anormales de DNA en tumores malignos. La hidrólisis ácida rompe los puentes de hidrógeno separando las hebras de DNA produciendo una depurinización, por lo tanto, para obtener un mayor número de grupos aldehído reactivos, identificables con reactivo de Schiff, es necesario realizar una hidrólisis que libere mayor cantidad de bases púricas.
Ejemplo de Curva de hidrólisis para Feulgen obtenida experimentalmente
Análisis de la curva de hidrólisis:
*Tiempo 0 min.: la muestra de tejido se encuentra con una intensidad de coloración prácticamente nula ya que el DNA no posee una cantidad grupos aldehídos expuestos suficiente como para reaccionar con reactivo de Schiff, y producir color, porque no fue sometido a un tratamiento de hidrólisis ácida que produzca depurinización con una regeneración de grupos aldehídos.
*Tiempo 0’ a 60’ (ascenso): durante los primeros 60’ en que el tejido a sido expuesto a la hidrólisis ácida se han ido rompiendo los puentes de hidrogeno, que unen la doble hélice, progresivamente liberando bases púricas generando grupos aldehídos (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba la base nitrogenada. A medida que aumenta el tiempo de hidrólisis se produce, por la depurinización, una mayor cantidad de grupos aldehídos expuestos que por reacción con el reactivo de Schiff, generan una coloración que se va haciendo mas intensa a medida que el tiempo de exposición al ácido es mayor.
*Tiempo 60’ a 90’ (meseta): durante estos 30’ de hidrólisis ácida se han liberado todas las bases púricas y pirimidicas del tejido sin producir una despolimerización del DNA, por lo que, se observa la máxima intensidad de coloración, con tonalidad fucsia, de los ácidos nucleicos.
*Tiempo 90’ a 120’ (descenso): durante estos 30’, en los que se trabajo, se pudo observar que el tiempo al que a sido expuesto el tejido al ácido clorhídrico a sido excesivo, por lo que, la hidrólisis ácida rompe las uniones tipo ester de la pentosa con los fosfatos en los C3 y C5 de forma progresiva hasta producir una despolimerización del DNA.
Bibliografía: Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third Edition, 1999.
