Aspectos generales de la metodología bioquímica
En la investigación bioquímica con frecuencia se necesita purificar un componente particular de entre una mezcla compleja. Diferenciamos 2 separaciones, las analíticas y las separativas.
En las analíticas el objetivo es identificar y estimar pequeñas cantidades de los compuestos, y generalmente no es necesario recuperar el compuesto después del proceso de separación . Para determinar la presencia de un compuesto en una mezcla se compara su comportamiento durante el proceso analítico con el de un compuesto conocido que se denomina “estándar” o “patrón”, y que se somete exactamente al mismo tratamiento.
La determinación cuantitativa del compuesto puede hacerse sin necesidad de purificación previa en algunos casos, en los que dicho componente posee una proporción única que lo caracteriza, como sucede con los ensayos de actividad encimática en extractos crudos o células enteras.
En cuanto a las separativas, el objeto es distinto. Se trata de aislar y recuperar una gran cantidad del compuesto en un grado de pureza para poder, con este compuesto aislado, estudiar sus propiedades químicas o biológicas. Las separativas requieren una mayor cantidad de material de partida que las analítica para garantizar un alto grado de recuperación del compuesto. Los métodos utilizados poseen una resolución menor que los métodos usados en las técnicas analíticas.
Usualmente los procesos de purificación de una molécula en bioquímica comienzan con técnicas preparativas que nos dan una buena cantidad de material ya purificado. A continuación se sigue purificando hasta que alcancemos el grado de pureza deseado. Normalmente a mayor pureza menor recuperación.
El material biológico usado en bioquímica
La experimentación en bioquímica puede llevarse a cabo de dos modos fundamentales, “in vivo” e “in vitro”.
El primer término se aplica a organismos multicelulares y utiliza plantas o animales enteros o también parte de los animales en las cuales determinados órganos están prefundidos con nutrientes. La perfusión implica el bombeo de una disolución isotónica cargada con nutrientes, fármacos u hormonas a través del órgano. Esta solución asume el papel de la circulación normal, aportando nutrientes y eliminando sustancias de desecho.
Los animales se utilizan en investigación fundamental así como en médica, veterinaria y en pruebas toxicológicas. Los animales más empleados son ratones, ratas y cobayas, debido a su bajo precio y facilidad de manejo, pero también otros animales como conejos, muy empleados para preparar anticuerpos. También son utilizados gatos, perros, monos, cerdos, etc...
Estos animales deben mantenerse en pequeños grupos homogéneos en lo relativo a edad, sexo, estado fisiológico, etc. y controlados desde el punto de vista de nutrición, posibles enfermedades, entre otros.
Los resultados extraídos con experimentos con animales deben ser sometidos a la estadística, realizando experimentos con más animales.
Las plantas enteras se han necesitado en investigación básica para el estudio de procesos como la fotosíntesis, respiración, asimilación del nitrógeno... pero también para investigación aplicada en campos como loa patología, polución, tecnología de los alimentos,etc.
Las plantas, según las necesidades del experimento y especie, pueden obtenerse de plantaciones de exterior o de invernadero. La utilización de estos últimos tiene la ventaja de que se controlan aspectos como la temperatura, humedad, iluminación, entre otros.
Los “in vitro” implican la incubación del material biológico en ambientes físico – químicos artificiales. Este término se aplica a preparaciones encimáticas, órganos prefundidos pero aislados del animal, microorganismos intactos y a partes escindidas de animales o plantas.
También se usa en la experimentación in vitro células desagregadas de tejidos animales por tratamiento con encimas como la tripsina o colagenasa, que degradan la matriz extracelular que mantiene los tejidos y órganos unidos.
En un órgano normalmente coexisten varios tipos de células. Para separar estos tipos se usan dos métodos fundamentalmente. Por una parte la centrifugación que separa las células en función de su tamaño. Más recientemente se desarrollaron los denominados clasificadores de células activadas por fluorescencia, que consisten en que una suspensión celular se trata con una anticuerpo marcado con fluorescencia (unido a un componente fluorescente) que se dirige contra un antígeno de la superficie celular que está presente en cantidades diferentes en los distintos tipos de células. A continuación las células can pasando en fila de una a una por un rayo láser y se van separando físicamente de acuerdo con la cantidad de fluorescencia que presenta cada una. Estos aparatos son capaces de separar varios miles de células por segundo.
Además, para la experimentación in vitro también se pueden usar las células animales o vegetales en cultivo. La ventaja de la utilización de los cultivos es que obtenemos poblaciones homogéneas y además en condiciones controladas de manera que podemos inducir o reprimir un determinado encima o ruta metabólica.
En general, podemos decir que los métodos de esta investigación han permitido avanzar más rápido en los experimentos bioquímicos, aunque recibe una dura crítica ya que no siempre sucede lo mismo cuando estas células están en el laboratorio en cultivo que cuando están en vivo en el órgano.
Técnicas de homogenado de tejidos y fraccionamiento de orgánulos celulares
El primer paso en cualquier proceso analítico en el cual el contenido celular deba ser liberado, consiste en la homogeneización de tejidos y la rotura de celular. Esto nos proporciona una mezcla cruda que se puede utilizar como material de partida en procesos analíticos, o para la determinación de actividades encimáticas o estudios metabólicos cuando la incorporación de un determinado metabolito por el tejido intacto sea difícil. También podemos usar otros tejidos homogeneizados para la separación de los componentes celulares (fraccionamiento celular), en experimentos de compartimentación metabólica (determinar en qué parte de la célula se produce un proceso o ruta metabólica).
El material biológico que se va a homogeneizar se debe seleccionar de modo que sea rico en los orgánulos de interés, y además muy activo en la vía metabólica que se va a estudiar.
Por ejemplo, si queremos estudiar la cadena respiratoria, seleccionaremos un tejido rico en mitocondrias, como el hígado fresco. Si quisiésemos aislar núcleos, tomaríamos un trozo de timo. Además tenemos que tomar la precaución especial de que la solución en la que se lleva a cabo la homogeneización debe ser isotónica (generalmente disoluciones de sacarosa). El fraccionamiento celular se hace mediante centrifugación diferencial ( a diferentes velocidades y durante tiempos distintos), así es posible separar núcleos, cloroplastos, lisosomas, mitocondrias, microsomas. El contenido del citosol permanece en el sobrenadante de la última centrifugación.
Muchas encimas y proteínas son termolábiles (se desnaturalizan por acción de la temperatura) por lo tanto estos procesos de homogeneización deben realizarse en frío (generalmente a 4 ºC en cámaras frías).
Los métodos empleados para la disyunción de las células se basan fundamentalmente en que en general, las células cultivadas son fáciles de romper. Esto se consigue por choque osmótico, ciclos de congelación – descongelación, o por digestión con enzimas (proteasas y lipasas).
Otra manera de romper las células animales es el caso de disolventes orgánicos como el tolueno . sin embargo, levaduras y células vegetales poseen un pared celular resistente y dura que requiere que para romperla se combinen métodos encimáticos y mecánicos. Los métodos encimáticos implican el tratamiento de las células vegetales con pectinasas y celulasas. En el caso de levaduras su pared se rompe con la lisocima (mezcla de encimas).
Entre los métodos físicos tenemos:
A) Molido con mortero ( en presencia de un agente abrasivo como alúmina)
B) Agitación en presencia de pequeñas bolas de vidrio (es muy usado en levaduras, pero en las plantas se pueden dañar los orgánulos).
También se utilizan homogeneizadores que son sistemas de extrusión o prensas (prensa francesa es la más usada con levaduras).
Otra manera es la ruptura celular por ultrasonidos. Es muy empleada con bacterias y su pared. Los ultrasonidos son eficaces pero presentan un inconveniente, la muestra se calienta mucho, con lo que debemos actuar de manera esporádica y enfriando la muestra entre aplicación y aplicación.
El material biológico lo conservamos con la técnica del frío, que es la más utilizada, congelando la muestra en nitrógeno líquido, porque se considera que las reacciones bioquímicas se detienen a –130 ºC, y el punto de ebullición del nitrógeno es de -196 ºC, con lo que nos asegura la baja temperatura requerida. Normalmente esta congelación se hace en presencia de un componente protector, que suele ser glicerol, que evita la formación intracelular de cristales de hielo como consecuencia de la congelación rápida que al descongelar provocaría la lisis de las membranas celulares.
Precipitación fraccionada y centrifugación
La precipitación fraccionada es una fase preparativa de la purificación de proteínas. Se realiza con sales, comúnmente sulfato amónico.
Se basa en que en soluciones salinas concentradas, unas proteínas son más solubles que otras, y así podemos separar distintas fracciones proteicas.
El objetivo de la centrifugación es acelerar la sedimentación de sustancias químicas, células, partículas... creando campos gravitatorios artificiales mucho más intensos que el terrestre. Estos campos gravitatorios artificiales se consiguen haciendo girar la muestra a gran velocidad en unos aparatos llamados “centrífugas”. Las centrífugas de uso habitual alcanzan entre 3.000 G y 10.000 G , siendo 1G = aceleración de la gravedad terrestre. En cuanto a las ultracentrífugas, estas alcanzan 400.000 G debido a su mayor velocidad de rotación y a su actuación en vacío.
En las centrifugaciones los tubos que contienen la muestra se colocan en una pieza que gira y que se llama “rotor”. Para la centrifugación es esencial que el centro de gravedad del rotor coincida con el eje de rotación. Para ello, es imprescindible que los tubos con la muestra se coloquen equilibrados en el rotor, situándolos simétricamente con pesos iguales.
Mediante la centrifugación las partículas se separan en función de una característica que es el coeficiente de sedimentación, simbolizado por “S” y sus unidades son los “svedverg”, siendo 1 S = segundos. “S” aumenta con la masa de las partículas pero la relación no es lineal. Podemos usar la centrifugación simplemente para eliminar partículas grandes o agregados de una solución de moléculas. Para ello es suficiente usar un rotor de ángulo fijo y a una velocidad baja. Esto se suele hacer por ejemplo para purificar proteínas.
La centrifugación también puede utilizarse para separar distintos tipos de partículas o moléculas grandes unas de otras. En este caso la variante de la técnica que se aplica es la “centrifugación en gradiente de sacarosa”, en la que se coloca la muestra en un tubo con una disolución de sacarosa con distintas concentraciones a distintas alturas del tubo, estando la más concentrada abajo. El gradiente se consigue con un aparato especial que va dejando caer en el tubo cantidades de sacarosa a distintas concentraciones.
La muestra la colocamos en la parte superior del gradiente y en principio quedará flotando por diferencia de densidad. Luego centrifugamos con un “rotor oscilante” o “basculante”. Aquí el tubo cuelga del rotor por una bisagra, y queda en posición horizontal debido a la fuerza centrífuga al rotar. Esta fuerza situará en bandas a los distintos componentes de la muestra según sus densidades en las distintas concentraciones de sacarosa.
Finalmente separamos estas bandas perforando el fondo del tubo (que suele ser de plástico) con una jeringuilla y tomamos cada una de las fracciones.
Ésta es una técnica preparativa porque recuperamos el componente de la muestra a purificar. Si lo que queremos separar son más proteínas debemos recurrir a la ultracentrifugación.
La técnica de sacarosa puede usarse también en ultracentrifugación , que puede usarse de modo analítico. Con las proteínas la analítica nos permite averiguar los coeficientes de sedimentación de las proteínas y así caracterizarlas según este parámetro.
FUENTE: www.aibarra.org/apuntes/biofisica_bioquimica
En la investigación bioquímica con frecuencia se necesita purificar un componente particular de entre una mezcla compleja. Diferenciamos 2 separaciones, las analíticas y las separativas.
En las analíticas el objetivo es identificar y estimar pequeñas cantidades de los compuestos, y generalmente no es necesario recuperar el compuesto después del proceso de separación . Para determinar la presencia de un compuesto en una mezcla se compara su comportamiento durante el proceso analítico con el de un compuesto conocido que se denomina “estándar” o “patrón”, y que se somete exactamente al mismo tratamiento.
La determinación cuantitativa del compuesto puede hacerse sin necesidad de purificación previa en algunos casos, en los que dicho componente posee una proporción única que lo caracteriza, como sucede con los ensayos de actividad encimática en extractos crudos o células enteras.
En cuanto a las separativas, el objeto es distinto. Se trata de aislar y recuperar una gran cantidad del compuesto en un grado de pureza para poder, con este compuesto aislado, estudiar sus propiedades químicas o biológicas. Las separativas requieren una mayor cantidad de material de partida que las analítica para garantizar un alto grado de recuperación del compuesto. Los métodos utilizados poseen una resolución menor que los métodos usados en las técnicas analíticas.
Usualmente los procesos de purificación de una molécula en bioquímica comienzan con técnicas preparativas que nos dan una buena cantidad de material ya purificado. A continuación se sigue purificando hasta que alcancemos el grado de pureza deseado. Normalmente a mayor pureza menor recuperación.
El material biológico usado en bioquímica
La experimentación en bioquímica puede llevarse a cabo de dos modos fundamentales, “in vivo” e “in vitro”.
El primer término se aplica a organismos multicelulares y utiliza plantas o animales enteros o también parte de los animales en las cuales determinados órganos están prefundidos con nutrientes. La perfusión implica el bombeo de una disolución isotónica cargada con nutrientes, fármacos u hormonas a través del órgano. Esta solución asume el papel de la circulación normal, aportando nutrientes y eliminando sustancias de desecho.
Los animales se utilizan en investigación fundamental así como en médica, veterinaria y en pruebas toxicológicas. Los animales más empleados son ratones, ratas y cobayas, debido a su bajo precio y facilidad de manejo, pero también otros animales como conejos, muy empleados para preparar anticuerpos. También son utilizados gatos, perros, monos, cerdos, etc...
Estos animales deben mantenerse en pequeños grupos homogéneos en lo relativo a edad, sexo, estado fisiológico, etc. y controlados desde el punto de vista de nutrición, posibles enfermedades, entre otros.
Los resultados extraídos con experimentos con animales deben ser sometidos a la estadística, realizando experimentos con más animales.
Las plantas enteras se han necesitado en investigación básica para el estudio de procesos como la fotosíntesis, respiración, asimilación del nitrógeno... pero también para investigación aplicada en campos como loa patología, polución, tecnología de los alimentos,etc.
Las plantas, según las necesidades del experimento y especie, pueden obtenerse de plantaciones de exterior o de invernadero. La utilización de estos últimos tiene la ventaja de que se controlan aspectos como la temperatura, humedad, iluminación, entre otros.
Los “in vitro” implican la incubación del material biológico en ambientes físico – químicos artificiales. Este término se aplica a preparaciones encimáticas, órganos prefundidos pero aislados del animal, microorganismos intactos y a partes escindidas de animales o plantas.
También se usa en la experimentación in vitro células desagregadas de tejidos animales por tratamiento con encimas como la tripsina o colagenasa, que degradan la matriz extracelular que mantiene los tejidos y órganos unidos.
En un órgano normalmente coexisten varios tipos de células. Para separar estos tipos se usan dos métodos fundamentalmente. Por una parte la centrifugación que separa las células en función de su tamaño. Más recientemente se desarrollaron los denominados clasificadores de células activadas por fluorescencia, que consisten en que una suspensión celular se trata con una anticuerpo marcado con fluorescencia (unido a un componente fluorescente) que se dirige contra un antígeno de la superficie celular que está presente en cantidades diferentes en los distintos tipos de células. A continuación las células can pasando en fila de una a una por un rayo láser y se van separando físicamente de acuerdo con la cantidad de fluorescencia que presenta cada una. Estos aparatos son capaces de separar varios miles de células por segundo.
Además, para la experimentación in vitro también se pueden usar las células animales o vegetales en cultivo. La ventaja de la utilización de los cultivos es que obtenemos poblaciones homogéneas y además en condiciones controladas de manera que podemos inducir o reprimir un determinado encima o ruta metabólica.
En general, podemos decir que los métodos de esta investigación han permitido avanzar más rápido en los experimentos bioquímicos, aunque recibe una dura crítica ya que no siempre sucede lo mismo cuando estas células están en el laboratorio en cultivo que cuando están en vivo en el órgano.
Técnicas de homogenado de tejidos y fraccionamiento de orgánulos celulares
El primer paso en cualquier proceso analítico en el cual el contenido celular deba ser liberado, consiste en la homogeneización de tejidos y la rotura de celular. Esto nos proporciona una mezcla cruda que se puede utilizar como material de partida en procesos analíticos, o para la determinación de actividades encimáticas o estudios metabólicos cuando la incorporación de un determinado metabolito por el tejido intacto sea difícil. También podemos usar otros tejidos homogeneizados para la separación de los componentes celulares (fraccionamiento celular), en experimentos de compartimentación metabólica (determinar en qué parte de la célula se produce un proceso o ruta metabólica).
El material biológico que se va a homogeneizar se debe seleccionar de modo que sea rico en los orgánulos de interés, y además muy activo en la vía metabólica que se va a estudiar.
Por ejemplo, si queremos estudiar la cadena respiratoria, seleccionaremos un tejido rico en mitocondrias, como el hígado fresco. Si quisiésemos aislar núcleos, tomaríamos un trozo de timo. Además tenemos que tomar la precaución especial de que la solución en la que se lleva a cabo la homogeneización debe ser isotónica (generalmente disoluciones de sacarosa). El fraccionamiento celular se hace mediante centrifugación diferencial ( a diferentes velocidades y durante tiempos distintos), así es posible separar núcleos, cloroplastos, lisosomas, mitocondrias, microsomas. El contenido del citosol permanece en el sobrenadante de la última centrifugación.
Muchas encimas y proteínas son termolábiles (se desnaturalizan por acción de la temperatura) por lo tanto estos procesos de homogeneización deben realizarse en frío (generalmente a 4 ºC en cámaras frías).
Los métodos empleados para la disyunción de las células se basan fundamentalmente en que en general, las células cultivadas son fáciles de romper. Esto se consigue por choque osmótico, ciclos de congelación – descongelación, o por digestión con enzimas (proteasas y lipasas).
Otra manera de romper las células animales es el caso de disolventes orgánicos como el tolueno . sin embargo, levaduras y células vegetales poseen un pared celular resistente y dura que requiere que para romperla se combinen métodos encimáticos y mecánicos. Los métodos encimáticos implican el tratamiento de las células vegetales con pectinasas y celulasas. En el caso de levaduras su pared se rompe con la lisocima (mezcla de encimas).
Entre los métodos físicos tenemos:
A) Molido con mortero ( en presencia de un agente abrasivo como alúmina)
B) Agitación en presencia de pequeñas bolas de vidrio (es muy usado en levaduras, pero en las plantas se pueden dañar los orgánulos).
También se utilizan homogeneizadores que son sistemas de extrusión o prensas (prensa francesa es la más usada con levaduras).
Otra manera es la ruptura celular por ultrasonidos. Es muy empleada con bacterias y su pared. Los ultrasonidos son eficaces pero presentan un inconveniente, la muestra se calienta mucho, con lo que debemos actuar de manera esporádica y enfriando la muestra entre aplicación y aplicación.
El material biológico lo conservamos con la técnica del frío, que es la más utilizada, congelando la muestra en nitrógeno líquido, porque se considera que las reacciones bioquímicas se detienen a –130 ºC, y el punto de ebullición del nitrógeno es de -196 ºC, con lo que nos asegura la baja temperatura requerida. Normalmente esta congelación se hace en presencia de un componente protector, que suele ser glicerol, que evita la formación intracelular de cristales de hielo como consecuencia de la congelación rápida que al descongelar provocaría la lisis de las membranas celulares.
Precipitación fraccionada y centrifugación
La precipitación fraccionada es una fase preparativa de la purificación de proteínas. Se realiza con sales, comúnmente sulfato amónico.
Se basa en que en soluciones salinas concentradas, unas proteínas son más solubles que otras, y así podemos separar distintas fracciones proteicas.
El objetivo de la centrifugación es acelerar la sedimentación de sustancias químicas, células, partículas... creando campos gravitatorios artificiales mucho más intensos que el terrestre. Estos campos gravitatorios artificiales se consiguen haciendo girar la muestra a gran velocidad en unos aparatos llamados “centrífugas”. Las centrífugas de uso habitual alcanzan entre 3.000 G y 10.000 G , siendo 1G = aceleración de la gravedad terrestre. En cuanto a las ultracentrífugas, estas alcanzan 400.000 G debido a su mayor velocidad de rotación y a su actuación en vacío.
En las centrifugaciones los tubos que contienen la muestra se colocan en una pieza que gira y que se llama “rotor”. Para la centrifugación es esencial que el centro de gravedad del rotor coincida con el eje de rotación. Para ello, es imprescindible que los tubos con la muestra se coloquen equilibrados en el rotor, situándolos simétricamente con pesos iguales.
Mediante la centrifugación las partículas se separan en función de una característica que es el coeficiente de sedimentación, simbolizado por “S” y sus unidades son los “svedverg”, siendo 1 S = segundos. “S” aumenta con la masa de las partículas pero la relación no es lineal. Podemos usar la centrifugación simplemente para eliminar partículas grandes o agregados de una solución de moléculas. Para ello es suficiente usar un rotor de ángulo fijo y a una velocidad baja. Esto se suele hacer por ejemplo para purificar proteínas.
La centrifugación también puede utilizarse para separar distintos tipos de partículas o moléculas grandes unas de otras. En este caso la variante de la técnica que se aplica es la “centrifugación en gradiente de sacarosa”, en la que se coloca la muestra en un tubo con una disolución de sacarosa con distintas concentraciones a distintas alturas del tubo, estando la más concentrada abajo. El gradiente se consigue con un aparato especial que va dejando caer en el tubo cantidades de sacarosa a distintas concentraciones.
La muestra la colocamos en la parte superior del gradiente y en principio quedará flotando por diferencia de densidad. Luego centrifugamos con un “rotor oscilante” o “basculante”. Aquí el tubo cuelga del rotor por una bisagra, y queda en posición horizontal debido a la fuerza centrífuga al rotar. Esta fuerza situará en bandas a los distintos componentes de la muestra según sus densidades en las distintas concentraciones de sacarosa.
Finalmente separamos estas bandas perforando el fondo del tubo (que suele ser de plástico) con una jeringuilla y tomamos cada una de las fracciones.
Ésta es una técnica preparativa porque recuperamos el componente de la muestra a purificar. Si lo que queremos separar son más proteínas debemos recurrir a la ultracentrifugación.
La técnica de sacarosa puede usarse también en ultracentrifugación , que puede usarse de modo analítico. Con las proteínas la analítica nos permite averiguar los coeficientes de sedimentación de las proteínas y así caracterizarlas según este parámetro.
FUENTE: www.aibarra.org/apuntes/biofisica_bioquimica
