Para estudiar la estructura intema de los procariotas es esencial el uso del microscopio electrónico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones pasan a través de la preparación algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiación de los electrones es mucho más pequeña que la de la luz visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada, la resolución obtenìda con el microscopio electrónico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio optico.
Mientras que con el microscopio optico ordinario o el de contraste de fases las estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0,2 µm, con el microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0,001 µm. Con el microscopio electrónico es posible ver mucbas sustancias incluso de tamaño molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados: si se está interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente.
Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizándose habitualmente esto último transfiriendo las células a un disolvente orgánico. Después de la deshidratación, la muestra es incluida en plástico y en este plástico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el microscopio electrónico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrónica, tales como ácido ósmico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales están compuestos por átomos de elevado peso molecular y, por elIo, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teñidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y; por tanto, se ven mejor.
Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrónico es la tinción negativa. Se aplica el mismo principio que en la tinción negativa del microscopio óptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas más comúnmente utilizadas en la microscopia electrónica se realiza con ácido fosfovolfrámico (fosfotúngstico). Para examinar las superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrónico.
Otra técnica de la microscopía electrónica recientemente desarrollada es la de criocorrosión que evita la formación de artefactos al eliminar la fijación química y la inclusión. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento químico, y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, de tal modo que se eliminan porciones de las superficies de las células. Se hacen y se examinan entonces réplicas en carbono de esas superficies, pudiéndose observar estructuras superficiales o internas de las células. La mayoría de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas químicamente se ven también en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos.
Fuente:
Mientras que con el microscopio optico ordinario o el de contraste de fases las estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0,2 µm, con el microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0,001 µm. Con el microscopio electrónico es posible ver mucbas sustancias incluso de tamaño molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados: si se está interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente.
Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizándose habitualmente esto último transfiriendo las células a un disolvente orgánico. Después de la deshidratación, la muestra es incluida en plástico y en este plástico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el microscopio electrónico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrónica, tales como ácido ósmico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales están compuestos por átomos de elevado peso molecular y, por elIo, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teñidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y; por tanto, se ven mejor.
Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrónico es la tinción negativa. Se aplica el mismo principio que en la tinción negativa del microscopio óptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas más comúnmente utilizadas en la microscopia electrónica se realiza con ácido fosfovolfrámico (fosfotúngstico). Para examinar las superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrónico.
Otra técnica de la microscopía electrónica recientemente desarrollada es la de criocorrosión que evita la formación de artefactos al eliminar la fijación química y la inclusión. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento químico, y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, de tal modo que se eliminan porciones de las superficies de las células. Se hacen y se examinan entonces réplicas en carbono de esas superficies, pudiéndose observar estructuras superficiales o internas de las células. La mayoría de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas químicamente se ven también en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos.
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