Tecnología Médica Mención Morfofisiopatología y Citodiagnóstico: Microscopio Electrónico

Se dispone de varios tipos de microscopios para el estudio de material biológico (células y tejidos).

Para la observación en alto vacío el material debe cumplir con dos requisitos: estar seco y ser conductivo. Los pasos a seguir para acondicionarlas son los siguientes:
*Fijación: Se realiza a fin de detener los procesos fisiológicos del material y conservarlos lo mas parecido posible al estado vivo. Se usa una mezcla de solventes como el FAA (formol, alcohol y ác. Acético).
*Deshidratación: El agua presente en las muestras y/o en los fijadores al evaporarse, produce contaminación de la columna del MEB y deformación de la superficie de la muestra. Por ello los especímenes deben deshidratarse y secarse para su observación. La deshidratación se realiza por tratamiento del material en una serie acetónica ascendente. El secado se lleva a cabo por el proceso de punto crítico, que consiste en reemplazar la acetona por anhídrido carbónico (CO2) líquido, el cual pasa a la fase gaseosa sin generar calor de evaporación. De este modo las muestras se secan sin colapsarse, ya que no están sujetas a los daños causados por la tensión superficial.
*Metalización: Los especímenes a observar se recubren con una delgada capa de material conductivo (Au, Au/Pd, C), a fin de evitar los fenómenos de carga y daño por barrido de electrones a la muestra. El procedimiento para lograr este recubrimiento es la evaporación del metal en atmósfera de plasma de Argón.

Introducción
Un microscopio es, básicamente, un sistema óptico que transforma un objeto en una imagen, la cual amplifica (magnifica) detalles característicos del objeto.
Con el microscopio de luz se resuelven detalles del orden del micrón, mientras que con el microscopio electrónico se alcanzan a resolver objetos del orden de los angstrom.
En el microscopio electrónico, un haz de electrones incide sobre una muestra y de la interacción de estos electrones con los átomos de la misma, surgen señales que son captadas por algún detector o bien, proyectadas directamente sobre una pantalla.
Dentro de la familia de microscopios electrónicos, se encuentran el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes características de una muestra. El SEM provee información sobre morfología y características de la superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultraestructurales.
Un gran avance se ha alcanzado con la incorporación de técnicas de procesamiento de imágenes para revelar detalles específicos de interés, algunos de ellos ligados a la ultraestructura de la muestra.

Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones.
El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quiénes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

Un microscopio electrónico funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscópios electrónicos sólo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor monocromático.

Comparación entre microscopios de luz y electrónico
Los microscopios de luz y electrónico son esencialmente, idénticos. Tanto uno como otro nos permiten amplificar aquellos objetos que son indistinguibles a nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminación. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, el microscopio electrónico emplea un haz de electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resolución.
Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuación. Cabe destacar que la misma, involucra características generales de los microscopios electrónicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM.

Resolución
El concepto de resolución está relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen. En otras palabras, es la distancia mínima r1 a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas.

La resolución teórica del microscopio electrónico es:

Para valores de l = 0.037 Å y a = 0.1 radianes, la resolución nominal es 0.2 Å.

Naturaleza de las ondas de electrones
De Broglie mostró que una partícula moviéndose a una velocidad cercana a la de la luz tenía una forma de radiación asociada con ella. Esta relación está expresada por:

donde l es la longitud de onda, h la costante de Plank, m la masa de la partícula y v su velocidad.

Si la partícula es un electrón y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, l = 0.05 A. que es 100.000 veces más corta que la luz verde. Por lo tanto, la resolución de un microscopio que emplee este tipo de radiación será mucho mejor que la de un microscopio de luz.
La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difícil de entender en términos de la física clásica y su descripción se hace mediante la mecánica cuántica.

Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de radiación que acompaña a cada electrón en su trayectoria, es parte de él y permanece con él. Las características de estas ondas dependen de la posición exacta de un dado electrón en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrón en esa posición.
Las ondas de electrones no deben confundirse con radiación electromagnética, como la que se produce cuando un haz electrónico interactúa con la materia, pierde energía y produce una radiación cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagnético.

Limitaciones del microscopio electrónico
*El limitado diámetro de la apertura no permite que la información detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolución.
*El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al constraste de difracción, provocado por la pérdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes gruesos.
*El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes finos.
*Existen también distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmática, esférica y cromática
*El problema de la función de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un sistema óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas.

El material biológico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vacío y la transferencia de energía. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas dependiendo del tamaño de la muestra:
* Para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas:
1. La fijación química o la criofijación
2. La inclusión en resinas (criosustitución)
3. La réplica metálica
* Para muestras pequeñas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas:‏
1. La tinción negativa: los agentes de tinción más usados son el molibdato amónico, el fosfotungstato sódico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactúan mínimamente con la muestra y son estables en la interacción con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusión, tienen un tamaño de grano pequeño.
2. La réplica metálica: para construir la réplica metálica se evapora el metal (estaño), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vacío, se disuelve.
3. La criomicroscopía

Aplicaciones
En el estudio de los circuitos integrados se suele utilizar el microscopio electrónico debido a una curiosa propiedad: Como el campo eléctrico modifica la trayectoria de los electrones, en un circuito integrado en funcionamiento, visto bajo el microscopio electrónico, se puede apreciar el potencial al que está cada elemento del circuito.

Tipos de microscopios electrónicos
Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).

Microscopio electrónico de transmisión (MET)
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Permite la observación de muestra en cortes ultrafinos. Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Reemplaza la luz visible por un haz de electrones que produce un muy alto poder de resolución.
En este sistema se reemplazan los lentes (cristales) por campos electromagnéticos, estos producen la amplificación de la imagen. Este haz de electrones viaje en un tubo de alto vacío, la imagen formada es registrada en la pantalla (monitor) o en una placa fotográfica. La formación de la imagen depende de la dispersión de los electrones. La imagen se debe a la ausencia de esos electrones. Depende del número atómico (de los átomos presentes en el objeto) y del grosor del objeto.
Los cortes son de 1/40 micras (250 Armstrong) de espesor. Se pueden obtener aumentos de hasta 160.000 veces.

Instrumento
El sistema óptico-electrónico del microscopio electrónico de transmisión está constituído por las siguientes partes:
1. Cañón de electrones
2. Sistema de lentes
3. Pantalla fluorescente

Estos componentes están ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vacío.
El cañón de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte superior de la columna. Está constituído por un filamento (cátodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente más negativo que éste. El ánodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt.
El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones emitidos termoiónicamente por el cátodo son acelerados hacia el ánodo, pasan por la apertura circular central de éste y un haz de alta energía es emitido hacia la columna del microscopio.

El sistema de lentes está formado por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora. Las lentes condensadoras, en los microscopios, más modernos son dos. La primera, proyecta la imagen punto de entrecruzamiento demagnificada (spot size), mientras que la segunda controla su diámetro y el ángulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita al haz que incide sobre la muestra.
La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especímen. Es considerada el componente más importante del microscopio electrónico. Cualquier defecto en ésta, será magnificado y transmitido al resto del sistema óptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran medida, la resolución final y la corrección de las aberraciones.
Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente.
La pantalla del microscopio electrónico de transmisión está recubierta por una pintura de fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible.

Mediante el microscopio electrónico de transmisión podemos estudiar la ultraestruacura de un material orgánico oinorgánico. Para esto, existen diferentes formas de operación que posibilitan el estudio de una característica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales no- biológicos y biológicos podemos nombrar :
1. Determinación de estructura cristalina en minerales, metales, etc.
2. Estudio de catalizadores.
3. Determinación de impurezas, precipitados,etc.
4. Identificación de bordes de grano e interfaces en metales.
5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.
6. Determinación de tamaño de partícula en catalizadores, minerales,etc.
7. Identificación de planos cristalinos.
8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos.
9. Realización de estudios de histoquímica para identificxar compuestos específicos.
10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales.
11. Reconocimiento de virus.
12. Estudios de citoquímica.
13. Estudios de estructuras moleculares.

Microscopio electrónico de barrido (MEB)
En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.
Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.

A diferencia de los microscopios ópticos, el MEB utiliza un haz de electrones que se trasladan en una trayectoria libre de colisiones (columna de alto vacío) e interactúan con el espécimen, recorriendo la topografía de la muestra. El bombardeo de la muestra con el haz produce un elevado número de señales, las que son captadas por un detector y transformadas en una imagen.
El microscopio electrónico de barrido (SEM) es similar al microscopio electrónico de transmisión. Ambos tienen ciertas características comunes tales como un cañón de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vacío. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la información que se obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfología superficial.

En el microscopio electrónico de barrido, el haz electrónico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz , de manera que barra la muestra punto a punto. De la interacción entre los electrones incidentes con los átomos que componen la muestra se generan señales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados para cada una de ellas. El detector capta una señal y las convierte en una señal electrónica que es proyectada en un tubo de rayos catódicos (CRT).
El barrido del haz está sincronizado con el barrido del CRT y produce una relación uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT.
Un esquema del SEM se muestra en la siguiente figura.

Mediante el SEM se estudian:
1. Morfología superficial de minerales, catalizadores, etc.
2. Electrodepósitos
3. Adherencia fibra-matríz en polímeros.
4. Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.
5. Formas de cristalización de minerales.
6. Control de calidad de catalizadores industriales.
7. Morfología superficial interna de partículas poliméricas.
8. Morfología de tejidos u órgano animales y vegetales.
9. Estudio de moléculas
10. Reconocimiento de fósiles.

Interaccion haz incidente-Muestra en el SEM
Naturaleza de la interacción: Cuando el haz de electrones choca contra la muestra, ocurren interacciones entre dichos electrones y los átomos que componen la muestra. De allí surgen señales tales como: electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x característicos, electrones Auger, catodoluminiscencia. Todas estas señales se producen simultáneamente pero cada una de ellas son captadas por detectores diferentes.
Uno de los detectores más comunes es el de electrones secundarios. Los mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelásticas. Por esta razón, poseen baja energía (50 ev). Ellos brindan una imagen de la morfología superficial de la muestra.

Unidades de medida en microscopia
La unidad que se usa en microscopía de luz es el micrón (µ) que es la milésima parte del milímetro.
En microscopía electrónica la unidad más conocida es el angstrom (Å), definido como la diez millonésima parte del milímetro. También se emplea el nanometro (nm), que es la millonésima parte del micrón.

Así, por ejemplo, la resolución de un microscopio de luz es 0.25 µ ó 2500 Å ; y la de un microscopio electrónico de 2.5 Å.

Galeria de imagenes a Microscopio Electronico