Por lo general, los tejidos son estructuras blandas y frágiles, aunque el fijador utilizado aumente la dureza del tejido, estos son demasiado blandos y resultarían despedazados al tratar de cortarlos finamente, por lo que previo a la obtención de los cortes, es necesario incluirlos en un medio de soporte. Los medios más utilizados son las ceras o resinas, los que en estado líquido tienen la capacidad de penetrar y rodear el tejido, produciendo el endurecimiento (por enfriamiento o por polimerización), para formar un bloque sólido que pueda ser cortado fácilmente en el micrótomo. Existe otro método alternativo, que es la congelación rápida del tejido en un medio gelatinoso, que permite el corte tisular directo del fragmento congelado, que puede ser cortado en forma inmediata en un micrótomo especial denominado criostato. Los medios de inclusión de clasifican dependiendo de su afinidad con el agua existiendo medios hidrófobos como la parafina, celoidina y plásticos que necesariamente necesitan la extracción previa del agua y agregación de un medio intermedio miscible para poder agregarse a los intersticios del tejido, y los medios hidrófilos como la gelatina, agar, carbowax y los glicolmetalicratos que no necesitan una previa deshidratación y aclaramiento por lo que hay menor daño al tejido. El objetivo de la inclusión es hacer facilitar la sección del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz y ser examinados mediante el microscopio.
*Inclusión en parafina
Deshidratación: Los tejidos vivos poseen una gran cantidad de agua, la que evita la impregnación de medios de inclusión como la parafina, que es hidrófoba, por lo tanto, hay que eliminar el agua de los tejidos, para este paso se utilizaron soluciones acuosas de etanol (CH3CH2OH) en escala creciente, que se muestra en el protocolo de inclusión, el alcohol elimina el agua debido a que posee un grupo hidroxilo (-OH) que reacciona con el agua quitándola del tejido; se utiliza esta escala creciente por que si se sumerge el tejido de inmediato en el etanol absoluto, el agua saldría demasiado rápido del tejido, alterando su morfología característica. Se dejo en soluciones de alcohol crecientes de 70%, 95%, 95%, 100% y 100% durante 15 minutos cada una.
Aclaramiento o diafanización: Este paso es denominado aclaramiento porque los tejidos cambian su índice de refracción, volviéndose más transparentes, para esto se necesita una sustancia que sea miscible tanto en el agente deshidratante (el alcohol) como en el medio de inclusión (la parafina), en este caso, el agente elegido fue el Xilol, también conocido como xileno, químicamente denominado dimetilbenceno, es un anillo de benceno con dos grupos metilo unidos a él, presentando tres isoformas, en las que la posición de los dos grupos metilo varia en el anillo de benceno.
Se utiliza también como solvente y diluyente. Cabe destacar que es tóxico, sus vapores causan dolor de cabeza, nauseas niveles más altos pueden causar irritación de mucosas, problemas pulmonares y hasta inconciencia y muerte, se absorbe por vía respiratoria y por la piel; por esta razón se debe tener mucho cuidado en su manipulación, respetando siempre las normas de laboratorio. Para el procesamiento de muestras, se sumergieron los tejidos en soluciones de xilol I y II durante 15 minutos cada una.
Impregnación en parafina: Su composición es principalmente de hidrocarburos de cadenas rectas, sin ramificaciones. Están caracterizadas por tener una estructura "macro cristalina" (cristales grandes y quebradizos) y longitudes de C18 hasta C40. Su peso molecular oscila entre 320 y 560, presentan consistencia sólida a temperatura ambiente. Las parafinas son sometidas a procesos de refinación (eliminación del aceite) para dar como resultado una variedad de grados, clasificados por su punto de fusión.
Para procesos Histológicos se emplean parafinas con cadenas de 20 a 35 átomos con puntos de fusión de 38-58°C, llamadas parafinas histológicas. La parafina es una materia sólida, inerte, impermeable, ofrece una gran plasticidad, tienen una excelente estabilidad a la oxidación, además son no inflamables, no oxidantes, no corrosivos, no explosivos, no toxico, no asfixiante, no irritante, no radioactivas, es inolora e insípida.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina líquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Esto ocurre ya que al colocar la muestra de tejido en un recipiente con parafina fundida a 60°C el calor hace que el Xilol se evapore y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina. Se incluyo en parafinas I, II y III a 60°C y se formo el taco con parafina IV a 60°C.
Confección del taco: después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar por 10-15 minutos a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco o Bloque de parafina. Se pueden usar moldes que pueden ser de material plástico, metálico (placas de Leukart) o cartón, en donde se deposita el tejido, el cual es trasladado mediante una pinza tibia. Antes de posicionar el tejido en el molde se vierte un poco de parafina, se introduce la muestra y se posiciona, se pone el molde en una superficie fría, se espera a que se forma una película sólida y se vierte parafina caliente a 60°C en los moldes. Finalmente se espera a que solidifique completamente y se desprende del molde.
Protocolo de inclusión en parafina (medio hidrófobo)
1. Muestras frescas no mayores a 0,5 x 1,0 cm de espesor fijadas en HCHO 10 %, Bouin y Zenker (según Tabla N°1) durante 24 hrs a T° ambiente.
2. Muestras fijadas en Formol Neutro 10% y Bouin lavado en Alcohol 70% (15 min) y fijadas en Zenker en agua corriente (15 min).
3. ETOH 70 % por 15 min.
5. ETOH 95 % x 2, 15 min.
6. ETOH 100 % x 2, 15 min.
7. Xilol x 2, 15 min.
8. Parafina Histológica X 3, 30 min. a 60°C.
9. Inclusión final en parafina IV y formación del bloque de parafina.
*Inclusión en parafina
Deshidratación: Los tejidos vivos poseen una gran cantidad de agua, la que evita la impregnación de medios de inclusión como la parafina, que es hidrófoba, por lo tanto, hay que eliminar el agua de los tejidos, para este paso se utilizaron soluciones acuosas de etanol (CH3CH2OH) en escala creciente, que se muestra en el protocolo de inclusión, el alcohol elimina el agua debido a que posee un grupo hidroxilo (-OH) que reacciona con el agua quitándola del tejido; se utiliza esta escala creciente por que si se sumerge el tejido de inmediato en el etanol absoluto, el agua saldría demasiado rápido del tejido, alterando su morfología característica. Se dejo en soluciones de alcohol crecientes de 70%, 95%, 95%, 100% y 100% durante 15 minutos cada una.
Aclaramiento o diafanización: Este paso es denominado aclaramiento porque los tejidos cambian su índice de refracción, volviéndose más transparentes, para esto se necesita una sustancia que sea miscible tanto en el agente deshidratante (el alcohol) como en el medio de inclusión (la parafina), en este caso, el agente elegido fue el Xilol, también conocido como xileno, químicamente denominado dimetilbenceno, es un anillo de benceno con dos grupos metilo unidos a él, presentando tres isoformas, en las que la posición de los dos grupos metilo varia en el anillo de benceno.
Se utiliza también como solvente y diluyente. Cabe destacar que es tóxico, sus vapores causan dolor de cabeza, nauseas niveles más altos pueden causar irritación de mucosas, problemas pulmonares y hasta inconciencia y muerte, se absorbe por vía respiratoria y por la piel; por esta razón se debe tener mucho cuidado en su manipulación, respetando siempre las normas de laboratorio. Para el procesamiento de muestras, se sumergieron los tejidos en soluciones de xilol I y II durante 15 minutos cada una.
Impregnación en parafina: Su composición es principalmente de hidrocarburos de cadenas rectas, sin ramificaciones. Están caracterizadas por tener una estructura "macro cristalina" (cristales grandes y quebradizos) y longitudes de C18 hasta C40. Su peso molecular oscila entre 320 y 560, presentan consistencia sólida a temperatura ambiente. Las parafinas son sometidas a procesos de refinación (eliminación del aceite) para dar como resultado una variedad de grados, clasificados por su punto de fusión.
Para procesos Histológicos se emplean parafinas con cadenas de 20 a 35 átomos con puntos de fusión de 38-58°C, llamadas parafinas histológicas. La parafina es una materia sólida, inerte, impermeable, ofrece una gran plasticidad, tienen una excelente estabilidad a la oxidación, además son no inflamables, no oxidantes, no corrosivos, no explosivos, no toxico, no asfixiante, no irritante, no radioactivas, es inolora e insípida.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina líquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Esto ocurre ya que al colocar la muestra de tejido en un recipiente con parafina fundida a 60°C el calor hace que el Xilol se evapore y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina. Se incluyo en parafinas I, II y III a 60°C y se formo el taco con parafina IV a 60°C.
Confección del taco: después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar por 10-15 minutos a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco o Bloque de parafina. Se pueden usar moldes que pueden ser de material plástico, metálico (placas de Leukart) o cartón, en donde se deposita el tejido, el cual es trasladado mediante una pinza tibia. Antes de posicionar el tejido en el molde se vierte un poco de parafina, se introduce la muestra y se posiciona, se pone el molde en una superficie fría, se espera a que se forma una película sólida y se vierte parafina caliente a 60°C en los moldes. Finalmente se espera a que solidifique completamente y se desprende del molde.
Protocolo de inclusión en parafina (medio hidrófobo)
1. Muestras frescas no mayores a 0,5 x 1,0 cm de espesor fijadas en HCHO 10 %, Bouin y Zenker (según Tabla N°1) durante 24 hrs a T° ambiente.
2. Muestras fijadas en Formol Neutro 10% y Bouin lavado en Alcohol 70% (15 min) y fijadas en Zenker en agua corriente (15 min).
3. ETOH 70 % por 15 min.
5. ETOH 95 % x 2, 15 min.
6. ETOH 100 % x 2, 15 min.
7. Xilol x 2, 15 min.
8. Parafina Histológica X 3, 30 min. a 60°C.
9. Inclusión final en parafina IV y formación del bloque de parafina.
