Microscopía óptica convencional
1. Selección de la muestra
2. Fijación de la muestra
3. Inclusión de la muestra
4. Corte de la muestra
5. Tinción de los cortes
6. Montaje de los cortes
7. Examen de los cortes con el M.O.
*Fijación de la muestra
La fijación hace que precipiten las proteínas tisulares
Finalidad
– preservar los tejidos de forma similar a su estado “in vivo”
– aumentar la dureza de la muestra para facilitar su posterior corte
Fijadores usados
– formaldehído al 5%
– ácido pícrico
– alcohol,...
*Inclusión de la muestra en parafina
Finalidad
Endurecer la muestra homogéneamente para poder obtener cortes finos de ella
Método de inclusión en parafina
– deshidratar la muestra con alcoholes de gradación creciente (50% - 70% - 90% - 100%)
– pasar la muestra por un disolvente (benzol...)
– introducir la muestra en parafina líquida hasta que la muestra quede completamente embebida en parafina
– hacer un bloque de parafina sólida que contenga la muestra
Corte de la muestra
– Cortes de 5-10 μm de grosor
– Los cortes de la muestra se extienden en un portaobjetos de cristal
Tinción de los cortes
– corte deshidratado y montado en un portaobjetos
– desparafinizar los cortex con xilol
– rehidratar los cortes con alcoholes de gradación decreciente (100%.....50%.... agua)
– tinción de los cortes con un COLORANTE O MEZCLA DE COLORANTES
– aclarar el exceso de colorante (agua)
– deshidratar los cortes
– montar los cortes (resina + cubreobjetos de cristal)
– corte teñido dispuesto para ser estudiado con el M.O.
Métodos
– Hematoxilina-eosina
– Azan
– van Gieson
– Tinciones argénticas
– Tinciones histoquímicas
- PAS
- tinciones de lípidos
- histoquímica enzimática
- inmunocitoquímica
Hematoxilina-eosina
– color azul-violeta (hematoxilina): núcleo, ribosomas - REG
– color rosa (eosina): mitocondrias, proteínas citoplasmáticas, fibras de colágena (matriz extracelular)
Tinción de Azan
[AZocarmín + ANiline blue]
– color rojo: núcleos celulares
– color rosa: citoplasma celular [color rojo-naranja: fibras musculares y hematíes]
– color azul: fibras de colágena
Tinción de van Gieson
– color azul oscuro-negro: núcleos celulares
– color amarillo: citoplasma celular [hematíes]
– color rojo: fibras de colágena
Tinción con sales de plata
– color negro-marrón oscuro: fibras de reticulina, dendritas y axones neuronales prolongaciones gliales
Técnicas histoquímicas
– PAS
– tinciones de lípidos
– histoquímica enzimática
– inmunocitoquímica
Tinción P.A.S.
–color rosa-magenta: carbohidratos, mucoproteínas, proteoglicanos
- ác. peryódico + reactivo de Schiff (fucsina)
Tinciones de lípidos
– rojo Sudan
– tetróxido de osmio
Histoquímica de enzimas
– dehidrogenasas
– ATPasa
– fosfatasas ácidas
– fosfatasas alcalinas
– acetilcolinesterasa
– peroxidasa
Inmunocitoquímica
Detecta moléculas usando AC específicos para esas moléculas: DIRECTA, INDIRECTA, AC primario, AC secundario.
Montaje de los cortes
Resina sintética (DPX, Permount...) + Cubreobjetos de cristal
Estudio de los cortes
Microscopio óptico, Fuente de luz [Lámpara], Lente de campo, Condensador, Diafragma de apertura, Objetivo, Ocular, Platina
FUENTE: http://wzar.unizar.es/ACAD/HISTOLOGIA/texto/Tecnicas.pdf
1. Selección de la muestra
2. Fijación de la muestra
3. Inclusión de la muestra
4. Corte de la muestra
5. Tinción de los cortes
6. Montaje de los cortes
7. Examen de los cortes con el M.O.
*Fijación de la muestra
La fijación hace que precipiten las proteínas tisulares
Finalidad
– preservar los tejidos de forma similar a su estado “in vivo”
– aumentar la dureza de la muestra para facilitar su posterior corte
Fijadores usados
– formaldehído al 5%
– ácido pícrico
– alcohol,...
*Inclusión de la muestra en parafina
Finalidad
Endurecer la muestra homogéneamente para poder obtener cortes finos de ella
Método de inclusión en parafina
– deshidratar la muestra con alcoholes de gradación creciente (50% - 70% - 90% - 100%)
– pasar la muestra por un disolvente (benzol...)
– introducir la muestra en parafina líquida hasta que la muestra quede completamente embebida en parafina
– hacer un bloque de parafina sólida que contenga la muestra
Corte de la muestra
– Cortes de 5-10 μm de grosor
– Los cortes de la muestra se extienden en un portaobjetos de cristal
Tinción de los cortes
– corte deshidratado y montado en un portaobjetos
– desparafinizar los cortex con xilol
– rehidratar los cortes con alcoholes de gradación decreciente (100%.....50%.... agua)
– tinción de los cortes con un COLORANTE O MEZCLA DE COLORANTES
– aclarar el exceso de colorante (agua)
– deshidratar los cortes
– montar los cortes (resina + cubreobjetos de cristal)
– corte teñido dispuesto para ser estudiado con el M.O.
Métodos
– Hematoxilina-eosina
– Azan
– van Gieson
– Tinciones argénticas
– Tinciones histoquímicas
- PAS
- tinciones de lípidos
- histoquímica enzimática
- inmunocitoquímica
Hematoxilina-eosina
– color azul-violeta (hematoxilina): núcleo, ribosomas - REG
– color rosa (eosina): mitocondrias, proteínas citoplasmáticas, fibras de colágena (matriz extracelular)
Tinción de Azan
[AZocarmín + ANiline blue]
– color rojo: núcleos celulares
– color rosa: citoplasma celular [color rojo-naranja: fibras musculares y hematíes]
– color azul: fibras de colágena
Tinción de van Gieson
– color azul oscuro-negro: núcleos celulares
– color amarillo: citoplasma celular [hematíes]
– color rojo: fibras de colágena
Tinción con sales de plata
– color negro-marrón oscuro: fibras de reticulina, dendritas y axones neuronales prolongaciones gliales
Técnicas histoquímicas
– PAS
– tinciones de lípidos
– histoquímica enzimática
– inmunocitoquímica
Tinción P.A.S.
–color rosa-magenta: carbohidratos, mucoproteínas, proteoglicanos
- ác. peryódico + reactivo de Schiff (fucsina)
Tinciones de lípidos
– rojo Sudan
– tetróxido de osmio
Histoquímica de enzimas
– dehidrogenasas
– ATPasa
– fosfatasas ácidas
– fosfatasas alcalinas
– acetilcolinesterasa
– peroxidasa
Inmunocitoquímica
Detecta moléculas usando AC específicos para esas moléculas: DIRECTA, INDIRECTA, AC primario, AC secundario.
Montaje de los cortes
Resina sintética (DPX, Permount...) + Cubreobjetos de cristal
Estudio de los cortes
Microscopio óptico, Fuente de luz [Lámpara], Lente de campo, Condensador, Diafragma de apertura, Objetivo, Ocular, Platina
FUENTE: http://wzar.unizar.es/ACAD/HISTOLOGIA/texto/Tecnicas.pdf
